螞蟥生長(zhǎng)繁殖習(xí)性及其遺傳多樣性分子標(biāo)記研究.pdf

1、藥材水蛭為螞蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo nipponica Whitman和柳葉螞蟥Whitmania acranulata Whitman的干燥品，是常用的活血化瘀藥。目前心血管疾病給人類(lèi)健康造成的危害已經(jīng)越來(lái)越大，并已成為人類(lèi)死亡的第一殺手，而以水蛭為主要原料的中成藥產(chǎn)品有望成為這一頑癥的克星，并且其抗炎作用可在飼料添加劑中進(jìn)行大力開(kāi)發(fā)應(yīng)用.因此水蛭已成為中西藥及飼料工業(yè)不可缺少的原料，且隨著

2、社會(huì)發(fā)展及其相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，其需求量仍將快速增長(zhǎng)，而野生資源卻日益枯竭致使供需矛盾非常突出.近幾年，水蛭已成為世界性的緊俏中藥材之一.1984年水蛭被列入動(dòng)物保護(hù)國(guó)際紅皮書(shū).保護(hù)現(xiàn)有的螞蟥野生資源已成當(dāng)務(wù)之急，為此螞蟥種質(zhì)資源亟待整理和評(píng)價(jià)，以便為螞蟥核心種質(zhì)資源庫(kù)的建立提供有力保障. 本研究首先從螞蟥內(nèi)臟結(jié)構(gòu)、皮膚表皮細(xì)胞類(lèi)型的分布等形態(tài)學(xué)研究開(kāi)始，進(jìn)一步研究了螞蟥的生理、生長(zhǎng)、繁殖習(xí)性和藥材中農(nóng)殘、重金屬的積累，并對(duì)不同炮制

3、品、不同種質(zhì)的螞蟥的內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行系統(tǒng)的評(píng)價(jià).在對(duì)其生理、生長(zhǎng)、繁殖習(xí)性研究的基礎(chǔ)上，收集了我國(guó)螞蟥分布區(qū)部分種質(zhì)資源，同時(shí)引入4個(gè)水蛭H.nipponica種群作為參照，在分子水平分析了螞蟥遺傳多樣性，了解其群體遺傳結(jié)構(gòu)和多態(tài)性水平，并進(jìn)行了類(lèi)群的劃分，為螞蟥和水蛭的資源保護(hù)利用策略和人工選育提供有力的理論依據(jù).其次，采用兩種方法開(kāi)發(fā)了螞蟥的微衛(wèi)星序列，并分析了其特點(diǎn)，為SSR分子標(biāo)記在螞蟥遺傳多樣性研究中的應(yīng)用和螞蟥種質(zhì)資源的鑒定奠定

4、了基礎(chǔ).具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： 1.螞蟥生長(zhǎng)繁殖習(xí)性及藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)研究 (1)應(yīng)用組織石蠟切片和顯微攝影方法，對(duì)螞蟥內(nèi)臟器官，包括口、咽、食管、嗉囊、腸、直腸、側(cè)盲囊、精巢、儲(chǔ)精囊、輸精管、射精球、前列腺、皮膚等進(jìn)行解剖觀察分析.明確了螞蟥的消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)器官和皮膚的組織結(jié)構(gòu)和作用，皮膚黏液細(xì)胞的類(lèi)型與分布，為進(jìn)一步研究螞蟥的生長(zhǎng)、繁殖習(xí)性和人工養(yǎng)殖及種質(zhì)鑒別提供參考依據(jù). (2)應(yīng)用呼吸室法研究了螞蟥的耗

5、氧率、耗氧量和窒息點(diǎn).結(jié)果表明平均體重為10g的螞蟥，15～35℃變溫條件下耗氧率變化在0.049～0.094mg·g-1·h-1之間，耗氧量在0.44～0.67mg·p-1·h-1之間，窒息點(diǎn)為0.90～1.51mg·L-1，20℃條件下耗氧率為0.044～0.058mg·g-1·h-1，耗氧量為0.19～0.77mg·p-1·h-1，窒息點(diǎn)為1.40·1.57mg·L-1。說(shuō)明螞蟥的耗氧率隨溫度的升高而上升，窒息點(diǎn)隨溫度的升高而降低

6、，體重與耗氧率呈負(fù)相關(guān)，與耗氧量呈正相關(guān)，白晝和夜晚耗氧率的差異不大. (3)研究了在不同溫度條件下不同體重螞蟥生長(zhǎng)攝食情況，以及螞蟥在24h內(nèi)的攝食規(guī)律.結(jié)果表明螞蟥生長(zhǎng)的適宜溫度是15～25℃，其飽食量隨著體重增大和溫度的升高而增加，攝食率隨個(gè)體增大而降低，在24h之內(nèi)螞蟥有兩個(gè)攝食高峰. (4)在不同溫度、體重條件下觀察了螞蟥產(chǎn)卵和孵化習(xí)性。結(jié)果表明，螞蟥產(chǎn)卵和孵化的最適溫度為25℃，產(chǎn)卵的最佳體重為20g左右；溫

7、度能影響螞蟥產(chǎn)卵前后的體重，而體重大小對(duì)產(chǎn)卵前后體重變化影響不明顯；當(dāng)卵重在0.1～2.0g之間時(shí)與孵出量成正比，當(dāng)卵重大于2.0g時(shí)孵出量反而有所下降。 (5)采用原子吸收分光光度計(jì)、原子熒光分光光度計(jì)和氣相色譜儀對(duì)螞蟥、基地土壤和養(yǎng)殖用水的重金屬與農(nóng)藥殘留進(jìn)行了比較分析.結(jié)果表明除螞蟥藥材中鉛超出國(guó)家現(xiàn)行有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)外，螞蟥藥材、養(yǎng)殖基地土壤和養(yǎng)殖用水六六六、DDT和重金屬殘留各項(xiàng)指標(biāo)均符合國(guó)家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn).建議今后在制訂國(guó)家有關(guān)標(biāo)

8、準(zhǔn)時(shí)，將類(lèi)似螞蟥類(lèi)等動(dòng)物的安全限量單獨(dú)列出. (6)采用《藥典》一部(2005版)的方法測(cè)定了野生和人工養(yǎng)殖螞蟥不同炮制品的水分、醇溶性浸出物、總灰分、酸不溶性灰分、抗凝血酶活性等指標(biāo)，用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測(cè)定了鐵、鋅、銅、鉻、鉛、鎘、汞等元素，比較了野生和人工養(yǎng)殖螞蟥不同炮制品的內(nèi)在質(zhì)量.結(jié)果表明，水分：人工養(yǎng)殖與野生炮制品兩者之間差異不顯著(P>0.05)；總灰分：滑石粉燙炮制品最高，與其它炮制品差異顯著(P<0.0

9、5)；酸不溶性灰分：滑石粉燙炮制品最高，與其他炮制品差異不顯著(P>0.05)；醇溶性浸出物：野生炮制品與人工養(yǎng)殖炮制品差異顯著(P<0.05)；抗凝血酶活性：野生和人工養(yǎng)殖生曬品均達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)，且二者之間差異不顯著(P>0.05)；人工養(yǎng)殖及野生螞蟥不同炮制品中除鉛超標(biāo)外，其余金屬元素含量均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。 (7)參考《藥典》一部(2005版)測(cè)定了不同種群螞蟥的水分、醇溶性浸出物、總灰分、酸不溶性灰分、抗凝血酶活性等指標(biāo)，采用

10、高效液相色譜法測(cè)定了其黃嘌呤，次黃嘌呤.結(jié)果表明南京人工養(yǎng)殖種群在水分、醇溶性浸出物、總灰分、酸不溶性灰分、抗凝血酶活性、黃嘌呤、次黃嘌呤等成分上均相對(duì)高于其他種群。 2.利用分子標(biāo)記技術(shù)分析我國(guó)螞蟥種質(zhì)資源遺傳多樣性 (1)以全國(guó)螞蟥主要分布區(qū)的8個(gè)省15份種質(zhì)225個(gè)樣本進(jìn)行遺傳多樣性分析.利用RAPD標(biāo)記技術(shù)分析，結(jié)果表明在物種水平上，多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPL)為99.66％，Nei'S基因多樣性指數(shù)(He)為0，3

11、599.種群水平上的多態(tài)位點(diǎn)百分率在30.30％～56.06％之間，平均為44.14％，最高為安徽馬鞍山，其次為江蘇溧陽(yáng)，最低為南京人工養(yǎng)殖。群體間遺傳分化系數(shù)(GST)為0.5539，種群間基因流(Nm)為0.4028。數(shù)據(jù)顯示種群間分化較大，種群內(nèi)存在一定程度變異。聚類(lèi)分析顯示，當(dāng)相似系數(shù)為0.80時(shí)，可將15份材料分為8個(gè)類(lèi)群，其中廣西桂林、廣東廣州、云南大理、安徽馬鞍山四個(gè)醫(yī)蛭種群與其它大部分螞蟥種群相似性較低. (2)

12、利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了螞蟥遺傳多樣性，結(jié)果表明，在物種水平上，PPL為99.56％，He為0，3490。種群水平上的PPL在25.00％～53.95％之間，平均為37.73％，最高為廣西桂林，其次為廣東廣州，最低為江蘇南京人工養(yǎng)殖.GST為0.5730，Nm為0.3727.結(jié)果也表明螞蟥種群間存在較高水平遺傳分化，種群內(nèi)也存在一定的遺傳變異.聚類(lèi)分析表明，當(dāng)相似系數(shù)為0.78時(shí)，可將供試的15個(gè)螞蟥種群分為5個(gè)類(lèi)群. (

13、3)SRAP標(biāo)記是一種新型技術(shù)，本文分析SRAP標(biāo)記在螞蟥遺傳多樣性研究上的適用性.結(jié)果表明在物種水平上，PPL為99.02％，He為0.3687.種群水平上PPL在31.69％～58.86％之間，平均為50.59％，最高為江西樂(lè)安，其次為江蘇溧陽(yáng)，最低為江蘇南京人工養(yǎng)殖.GST為0.4699，Nm為0.5641.聚類(lèi)分析顯示，當(dāng)相似系數(shù)為0.82時(shí)，可將15個(gè)種群分為6個(gè)類(lèi)群。將SRAP標(biāo)記結(jié)果同RAPD和ISSR結(jié)果分析比較，認(rèn)為該

14、新型標(biāo)記可以用于螞蟥遺傳多樣性研究. (4)通過(guò)測(cè)定螞蟥核糖體ITS堿基序列，分析其特點(diǎn)，了解種內(nèi)變異類(lèi)型.結(jié)果得到我國(guó)螞蟥主要的14個(gè)種群14個(gè)樣本rDNA中的ITS完全序列.ITS長(zhǎng)度為857～863bp.ITS堿基頻率差異顯著，ITS較為保守.根據(jù)兩者序列以鄰接法建立分子系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，表明螞蟥種內(nèi)至少存在3個(gè)變異類(lèi)型。結(jié)合RAPD、ISSR和SRAP三種分子標(biāo)記的研究結(jié)果，可將供試材料分為三個(gè)等級(jí)加以保護(hù)和利用. 3

15、.螞蟥微衛(wèi)星(SSR)的開(kāi)發(fā) SSR標(biāo)記具有共顯性特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)螞蟥微衛(wèi)星對(duì)于遺傳多樣性研究具有重要意義.通過(guò)分析評(píng)價(jià)兩種有代表性的SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)方法，為微衛(wèi)星開(kāi)發(fā)方法的選擇提供參考信息。在現(xiàn)有方法基礎(chǔ)上提出螞蟥微衛(wèi)星序列開(kāi)發(fā)的兩種策略. (1)根據(jù)鏈親和素磁珠和生物素特異結(jié)合的特性，將微衛(wèi)星探針5'端生物素化后與鏈親和素磁珠特異結(jié)合，用磁珠和探針的結(jié)合物與兩端連接已知序列人工接頭的螞蟥基因組DNA酶切片段雜交，洗脫未雜交

16、DNA片斷后，建立微衛(wèi)星文庫(kù).以此為模板用人工接頭序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物直接克隆，經(jīng)菌液PCR篩選后測(cè)序分析。 (2)將特異接頭連接到限制性?xún)?nèi)切酶消化的基因組DNA上，以此為模板用簡(jiǎn)并引物抑制性PCR獲得SSR文庫(kù)，克隆后經(jīng)過(guò)兩次菌液PCR篩選進(jìn)行測(cè)序分析.結(jié)果表明，這兩種方法可以快速、高效地開(kāi)發(fā)出微衛(wèi)星序列. (3)結(jié)合前面從基因組DNA中已開(kāi)發(fā)的微衛(wèi)星序列，分析了螞蟥SSR特點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)二核苷酸重復(fù)類(lèi)型在螞蟥