人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞在兩種Bruch膜替代物上的生長研究比較.pdf

1、背景:
　　 年齡相關(guān)性黃斑變性(Age-related Macular Degeneration，AMD)是發(fā)達(dá)國家55歲以上人群視力損害和致盲的首要病因。在我國，隨著人口的老齡化和衛(wèi)生保健水平的不斷提高，AMD的發(fā)病率也越來越高。根據(jù)臨床表現(xiàn)的不同，AMD分為萎縮型，（又稱干性或非滲出性）和滲出型（又稱濕性或盤狀黃斑變性）兩類。其中對視力危害最大的是濕性AMD患者，常常因黃斑部多發(fā)性視網(wǎng)膜色素上皮脫離(Retinal Pig

2、ment Epithelium Detachment，RPED)、脈絡(luò)膜新生血管形成(choroidal neovascularization，CNV)致視網(wǎng)膜下出血或出血性視網(wǎng)膜脫離或玻璃體積血，最終演變?yōu)楹髽O部廣泛的瘢痕形成，使黃斑中心凹的視功能喪失殆盡。因此科研人員一直在努力探索新的技術(shù)試圖終止或逆轉(zhuǎn)這種視力喪失，這些技術(shù)包括光動力療法(Photodynamictherapy, PDT)3、放療4、黃斑轉(zhuǎn)位5和藥物治療。PDT相對

3、于激光光凝最主要的優(yōu)勢在于:可以用于黃斑下CNV的治療;不損害神經(jīng)視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜而選擇性地阻塞病理狀態(tài)的新生血管，避免暗點(diǎn)的形成。盡管PDT為臨床治療AMD帶來了希望，但是仍存在一些問題，限制了其廣泛應(yīng)用:首先其適應(yīng)癥范圍狹窄，TAP研究6表明PDT對于典型性CNV占病變50％以上的CNV和隱匿性CNV有效，但僅有14％的患者治療后兩年內(nèi)視力有提高7;其次，CNV復(fù)發(fā)率高，一般每隔3個月就需要重復(fù)治療一次7;第三，PDT治療后也可能導(dǎo)致

4、視網(wǎng)膜脫離等嚴(yán)重并發(fā)癥8;第四，該療法費(fèi)用昂貴，患者的經(jīng)濟(jì)壓力巨大。藥物治療主要包括干擾素9、thalidomide10、曲安奈德11和抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Vascular Epithelial Growth Factor, VEGF)12,13。目前多項(xiàng)研究證實(shí)抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)作用的藥物有著比較樂觀的前景:Krzystolik等14在靈長類動物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)Ranibizumab可以降低CNV的發(fā)生率且減少病灶的滲漏。

5、近來有報(bào)道超過35％的經(jīng)典型CNV的濕性AMD患者在使用Ranibizumab治療，一年內(nèi)視力明顯提高15,16，未來有可能通過玻璃體腔持續(xù)不斷的給藥，提高藥物治療的有效性。目前認(rèn)為抗VEGF制劑（包括抗VEGF抗體及因子）是治療濕性AMD的主要方法，主要是通過阻斷VEGF作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物活動來達(dá)到治療濕性AMD的目的，這些生物活動包括視網(wǎng)膜下間隙新生血管復(fù)合物形成過程中活躍的有絲分裂和血管通透性增加17。但是抗VEGF制劑治療

6、濕性AMD仍具有局限性，表現(xiàn)在如下幾個方面:第一，抗VEGF制劑只能阻止未完全發(fā)育的新生血管管壁的滲漏，而對于AMD患者已經(jīng)形成的視網(wǎng)膜下新生血管膜則無效;第二，新生血管的形成還涉及其它信號通道的參與，是一個多因素的調(diào)控事件，因此僅僅阻斷多個調(diào)控因子之一的VEGF細(xì)胞內(nèi)信號可能并不能完全抑制新生血管的生成18;第三，抗VEGF制劑的全身吸收同時(shí)也擾亂了生理狀態(tài)下的血管形成，尤其是影響了心肌梗死后冠狀動脈側(cè)枝循環(huán)的建立與恢復(fù)以及傷口的愈合

7、19;第四，抗VEGF制劑需要反復(fù)、多次玻璃體腔注射，這些操作本身增加了發(fā)生視網(wǎng)膜脫離和眼內(nèi)炎的風(fēng)險(xiǎn)12。由于上述不利因素的存在，仍有必要探索治療AMD的其它可行辦法。
　　 要想找到一種有效治療AMD的方法，首先就要弄清楚AMD的病理發(fā)生機(jī)制。視網(wǎng)膜色素上皮(Retinal Pigment Epithelium，RPE)在AMD的病理發(fā)生上占據(jù)了重要位置。RPE由排列規(guī)則的六角形色素上皮細(xì)胞單層組成，構(gòu)成了視網(wǎng)膜的外屏障。RP

8、E細(xì)胞頂部的細(xì)胞外基質(zhì)稱為視網(wǎng)膜下間隙，由光感受器間的基質(zhì)(interphotoreceptormatrix，IPM)20,21充填。正常生理狀態(tài)下，RPE細(xì)胞的微絨毛朝向視網(wǎng)膜下間隙，通過IPM與光感受器緊密連接22。頂部的細(xì)胞膜發(fā)出微絨毛，形成致密的網(wǎng)狀組織，光感受器外節(jié)插入其間，形成兩層廣泛的接觸?；撞康募?xì)胞膜向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)陷，形成許多折疊，附著在Bruch膜(Bruch's membrane，BM)上。Bruch膜是一個五層結(jié)構(gòu)，

9、厚約1-4um，是連接RPE基底膜和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管的重要結(jié)構(gòu)。此外RPE細(xì)胞可以分泌抑制血管生成的色素上皮源性因子(PigmentEpithelial-Derived Factor PEDF)23、血管上皮生長因子(VascularEpithelial Growth Factor VEGF)24以及細(xì)胞外基質(zhì)。目前認(rèn)為AMD患者CNV可能與RPE細(xì)胞分泌VEGF和PEDF比率失調(diào)有關(guān)25。
　　 RPE是光感受器進(jìn)行新陳代謝所需

10、物質(zhì)的重要傳遞途徑。RPE的結(jié)構(gòu)和功能對維持正常視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能起著至關(guān)重要的意義。在人衰老的過程中，氧張力增加可導(dǎo)致RPE和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管損傷，進(jìn)而引發(fā)Bruch膜和脈絡(luò)膜慢性炎癥反應(yīng)。RPE和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管損傷和炎癥可導(dǎo)致異常細(xì)胞外基質(zhì)的形成，這些異常細(xì)胞外基質(zhì)可改變供給視網(wǎng)膜和RPE的營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，可能會促成RPE和視網(wǎng)膜的進(jìn)一步損害26，如視網(wǎng)膜、RPE和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管的萎縮以及CNV的長入。這些衰老體征最終促進(jìn)了AMD的病理

11、學(xué)發(fā)生27。AMD在病理發(fā)生學(xué)上主要分為早期和晚期2種類型。早期AMD以玻璃膜疣(drusen)的形成和RPE異常為特征。晚期AMD包括兩種臨床類型28:萎縮型/干性型和滲出型/濕性，后者主要以脈絡(luò)膜新生血管形成，跨過受損的Bruch膜長入上皮下和或視網(wǎng)膜下區(qū)域1導(dǎo)致RPE細(xì)胞的成片丟失和RPE-光感受器之間的屏障破壞為特征30。無論哪一種類型的AMD，導(dǎo)致AMD患者視力喪失的主要原因都是RPE片狀丟失和視網(wǎng)膜下纖維血管長入，破壞了RP

12、E與光感受器之間的屏障，導(dǎo)致與RPE緊密相連的光感受器細(xì)胞的丟失和凋亡31。
　　 近年來，隨著對AMD發(fā)病的分子和細(xì)胞機(jī)制的進(jìn)一步了解，有人提出了利用健康RPE移植治療AMD的概念?；赗PE的潛在調(diào)節(jié)功能以及對疾病過程的調(diào)控，理論上認(rèn)為RPE移植不僅可以恢復(fù)視網(wǎng)膜正常的解剖功能、重建光感受器和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管之間的代謝屏障，還能提供光感受器所需的支持功能?；诖?，很多學(xué)者先后開展了人RPE移植的研究。
　　 早期人RP

13、E移植的研究多是同種異體移植，受體移植排斥反應(yīng)導(dǎo)致移植后視功能恢復(fù)不明顯。后期雖然開展了自體RPE細(xì)胞移植，但效果不盡如人意。究其原因，大多數(shù)研究均采用RPE細(xì)胞懸液或RPE移植片進(jìn)行視網(wǎng)膜下移植，移植后這些細(xì)胞懸液或植片不能正常地貼附在病變的Bruch膜上，以孤立的細(xì)胞團(tuán)的方式存活，不能在黃斑中心凹下形成單層上皮細(xì)胞層;即使細(xì)胞能夠重新貼附，其分化的功能也明顯受到限制。而RPE細(xì)胞只有保持正常的細(xì)胞極性才得以發(fā)揮生理功能，雜亂無章分布

14、的RPE細(xì)胞無法重建功能。有研究表明在RPE移植的過程中供體健康RPE細(xì)胞很難附著在受體病變的Bruch膜上，而供體RPE細(xì)胞移植后必須重新附著在受體基質(zhì)上以避免凋亡。
　　 供細(xì)胞貼附的Bruch膜的質(zhì)量和數(shù)量直接決定了種植的人胚胎RPE細(xì)胞的命運(yùn)45,50。生理狀態(tài)下，RPE細(xì)胞自然貼附于Bruch膜，后者構(gòu)成了RPE細(xì)胞的基底膜。許多移植研究把這一層視為移植RPE細(xì)胞重新附著的支架6。Bruch膜厚約1-4um，主要有分為

15、5層:視網(wǎng)膜色素上皮基底膜;內(nèi)膠原層;彈力層;外膠原層和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管基底膜。Bruch膜由Ⅰ型和Ⅳ型膠原;粘連蛋白;纖維連接蛋白和彈性蛋白構(gòu)成，支持RPE細(xì)胞的貼附、視網(wǎng)膜營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)。Bruch膜的年齡和類型顯著影響移植細(xì)胞的重新附著46。貼附在Bruch膜基底層（尤其是年輕供體）可以使RPE細(xì)胞的存活率，增殖率和融合能力較貼附Bruch膜其它層高。有研究發(fā)現(xiàn)Bruch膜的內(nèi)層膠原層的老化改變會抑制附著于Bruch膜的R

16、PE細(xì)胞重新增殖17。此外老化的黃斑下Bruch膜并不支持移植RPE細(xì)胞的生存和分化45-46。未經(jīng)治療的老化黃斑下Bruch膜也不支持人胚胎RPE細(xì)胞的生存和分化，但經(jīng)過適當(dāng)治療后，Bruch膜卻可以在器官培養(yǎng)研究中支持移植RPE的生存和分化33。大量研究發(fā)現(xiàn)51-56， RPE細(xì)胞在健康的膜性基質(zhì)上生長能夠形成單細(xì)胞層，保持完整的生物學(xué)特征。
　　 基于上述發(fā)現(xiàn)，人們認(rèn)識到重建Bruch膜，恢復(fù)視網(wǎng)膜下間隙的解剖和功能是視網(wǎng)

17、膜RPE移植首要解決的關(guān)鍵問題之一57。如果通過重建受體Bruch膜，使移植的健康RPE細(xì)胞在重建的Bruch膜上正常生長、分化，就可能移植恢復(fù)視網(wǎng)膜正常的解剖功能、重建光感受器和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管之間的代謝屏障，恢復(fù)位于RPE上方的光感受器的視覺功能。為此許多實(shí)驗(yàn)室先后研究了各種生物的或合成的Bruch膜支架，試圖模仿Bruch膜的功能，提高RPE移植的成功率。到目前為止，合成高分子化合物如交聯(lián)膠原58、明膠59、纖維蛋白原60、生物組織

18、如Descement膜55、晶狀體前囊61-63和羊膜64-65已經(jīng)被嘗試用作RPE移植中的Bruch膜替代物的研究。首先RPE細(xì)胞在這些基質(zhì)上生長、分化形成上皮細(xì)胞單層，然后再進(jìn)行RPE單層細(xì)胞—Bruch膜性替代物的移植。但至今這些Bruch膜替代物均存在不同程度的缺陷，難以應(yīng)用于臨床，如交聯(lián)膠原由于厚度、穿透性差、不易降解等因素在移植過程中容易損傷視網(wǎng)膜66;明膠則不能為供體RPE細(xì)胞提供一個理想的附著面，難以保證移植細(xì)胞在受體病

19、變或缺失的Bruch膜上存活59;以纖維蛋白原60為基質(zhì)載體的移植RPE細(xì)胞在視網(wǎng)膜下間隙以多個散在的細(xì)胞片形式存在，難以維持細(xì)胞的極性，同樣不是理想的基質(zhì)膜的選擇。盡管從患者身上直接獲取的晶狀體前囊和Descement膜，可以避免移植排斥反應(yīng)的發(fā)生，但手術(shù)操作可能帶來創(chuàng)傷以及移植步驟繁瑣的問題63，因此亦不是理想的Bruch膜替代物。
　　 從上述Bruch膜替代物研究發(fā)現(xiàn)，要使RPE移植成功，移植RPE細(xì)胞必須重新貼附在結(jié)構(gòu)

20、特性與Bruch膜相類似的物質(zhì)上，才能維持正常的RPE細(xì)胞極性，并且能夠在視網(wǎng)膜下間隙準(zhǔn)確定位33。作為Bruch膜的替代物，首先應(yīng)該在厚度、滲透性、生物相容性方面與Bruch膜相似，并有助于細(xì)胞貼附。此外，還應(yīng)該有助于維持RPE上皮的特征，即功能性緊密連接、頂部微絨毛、光感受器外節(jié)層的吞噬作用和規(guī)則的上皮單層。
　　 組織工程學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用為RPE移植帶來了新的希望。作為RPE細(xì)胞生長的基質(zhì)膜，可生物降解并具有生物相容性的聚

21、酯聚合物如PLLA和PLGA（主要由聚酯纖維Polyester組成）67可以有效地支持RPE細(xì)胞生長，明顯改善體外培養(yǎng)的RPE細(xì)胞的生存率和極性，已經(jīng)得到美國FDA批準(zhǔn)使用于臨床。但僵硬的聚酯纖維在視網(wǎng)膜下間隙移植時(shí)容易損傷視網(wǎng)膜，而且降解過程中有可能產(chǎn)生神經(jīng)視網(wǎng)膜毒性，在一定程度上限制了聚酯纖維作為理想膜性基質(zhì)的應(yīng)用33。
　　 近十年來組織工程學(xué)納米技術(shù)的應(yīng)用，再次激發(fā)了人類研發(fā)類似原位細(xì)胞外基質(zhì)(native extrac

22、ellular matrix，ECM)的膜性支架的興趣。原位ECM不僅為細(xì)胞提供生理支持，還為細(xì)胞貼附、遷徙提供具有特殊腺體的基質(zhì)，進(jìn)而通過各種生長因子調(diào)控細(xì)胞的增殖和功能。原位ECM的一個顯著特征是具有納米級大小的生理結(jié)構(gòu)。膠原纖維和彈性纖維等結(jié)構(gòu)蛋白的纖維直徑在幾十至幾百納米范圍內(nèi)，納米級蛋白纖維相互整合形成的篩網(wǎng)為組織提供力量和彈性68。早在19世紀(jì)60年代就有納米級特征影響細(xì)胞行為的報(bào)道6。20～50nm的蝕刻硅膠納米級表面可以

23、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞貼附和羥基化酶的作用70;納米級表面結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的粘附71。有報(bào)道當(dāng)纖維直徑在60～200nm之間，生長在炭納米纖維上的成骨細(xì)胞粘附、增殖和堿性磷酸酶的活動均有增強(qiáng)，而其它種類的細(xì)胞如成纖維細(xì)胞，軟骨細(xì)胞和肌細(xì)胞的貼附并不受影響72。提示:納米級表面特征促進(jìn)粘附蛋白的形成，進(jìn)而影響細(xì)胞行為73。
　　 基底膜是一種非常重要的ECM，厚約40-120nm，是所有上皮和內(nèi)皮細(xì)胞生存的基礎(chǔ)。Bruch膜作為眼內(nèi)的一

24、種基底膜，在維持RPE的正常功能方面發(fā)揮著重要功能。Bruch膜纖維主要由Ⅳ型膠原和粘蛋白納米纖維組成，膜上的纖維、微孔等均以納米級大小存在。作為理想的膜性支架，其結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能應(yīng)盡可能與原位ECM類似，即化學(xué)組成和生理學(xué)結(jié)構(gòu)一致68。微孔納米纖維膜(Electrospun nanofibers，EPN)由于表面結(jié)構(gòu)與人體基底膜相似，是目前最具有發(fā)展前途的一種生物學(xué)材料68?；谏鲜鲅芯浚覀兺茰yEPN可能可以充當(dāng)Bruch膜的理想替

25、代物，促進(jìn)RPE細(xì)胞正常生長、分化，為RPE移植治療濕性AMD患者帶來新的曙光。盡管人們對聚酯膜(Polyester)作為移植中RPE細(xì)胞生長支架的研究有一定認(rèn)識，近年來蝕刻多空技術(shù)的出現(xiàn)可能會進(jìn)一步改善聚酯膜作為RPE細(xì)胞生長支架的性能，據(jù)我們所知，目前尚未見相關(guān)報(bào)道，本課題將通過EPN與蝕刻多空聚酯膜(Etched porepolyester, PET)兩種生物材料的對比研究，進(jìn)一步明確二者的優(yōu)缺點(diǎn)及未來作為RPE移植中Bruch膜

26、理想替代物的可能，為RPE移植成功治療AMD帶來新的希望。本研究分為三個部分:
　　 第一部分:人胚胎RPE細(xì)胞在微孔聚酰胺納米纖維膜和多空聚酯膜上的生長研究比較。應(yīng)用倒置熒光顯微鏡、免疫熒光染色和Western Blot法比較研究人胚胎RPE細(xì)胞在EPN和PET兩種潛在的 Bruch膜替代物上的生長、分化情況;借助掃描電鏡比較兩種替代物與在體Bruch膜的纖維排列的異同，為理想Bruch膜替代物的研究提供初步理論基礎(chǔ)。

27、　　 第二部分:成人RPE細(xì)胞在微孔聚酰胺納米纖維膜和多空聚酯膜上的生長研究比較。建立成人RPE細(xì)胞培養(yǎng)的方法，采用第一部分的方法，進(jìn)一步比較上述兩種材料作為理想Bruch膜替代物的可能性。
　　 第三部分:兩種Bruch膜替代物植入P21RCS大鼠視網(wǎng)膜下間隙的組織學(xué)觀察。通過玻璃體切割手術(shù)分別把EPN和PET植入視網(wǎng)膜下間隙，通過組織切片初步觀察兩種替代物植入視網(wǎng)膜下間隙的生物相容性。
　　 結(jié)果:
　　

28、1.EPN在超微結(jié)構(gòu)上與在體Bruch膜類似;
　　 2.EPN和PET均支持體外培養(yǎng)的人胚胎RPE細(xì)胞的生長和分化，轉(zhuǎn)換鈣離子濃度可以促進(jìn)RPE細(xì)胞在上述兩種Bruch膜替代物上的分化。免疫熒光染色以及Western Blot均證實(shí)上述兩種替代物上的RPE細(xì)胞能夠正常分化;
　　 3.盡管EPN支持人胚胎RPE細(xì)胞的貼壁生長、分化，但在常規(guī)培養(yǎng)第10天開始出現(xiàn)部分RPE細(xì)胞單層變薄，尤其是EPN游離面上的RPE細(xì)胞單層

29、不均一，呈網(wǎng)格狀改變;培養(yǎng)第15天，EPN游離面和塑料附著面均出現(xiàn)不同程度的RPE細(xì)胞脫落，膜表面暴露或破裂;而PET上培養(yǎng)的人胚胎RPE細(xì)胞單層雖然不規(guī)則，但能夠完整地附著在膜表面;
　　 4.通過高密度種植、轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基鈣離子濃度，可以成功培養(yǎng)老年人RPE細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)與人胚胎RPE細(xì)胞類似;
　　 5.高密度種植條件下，EPN上的成人RPE細(xì)胞生長分化優(yōu)于PET上的成人RPE細(xì)胞;
　　 6.作為Bruch膜

30、的理想替代物，除了具備纖維排列與Bruch膜內(nèi)膠原層相類似、具有納米級表面特征及滲透性特點(diǎn)外，大而平滑的表面可能更有利于RPE細(xì)胞單層的維持;
　　 7.P21RCS大鼠視網(wǎng)膜下間隙植入物的初步組織學(xué)研究提示EPN和PET在視網(wǎng)膜下間隙均具有生物相容性。
　　 結(jié)論:
　　 1.EPN由于結(jié)構(gòu)與Bruch膜相似，是一種具有發(fā)展前景的Bruch膜替代物;
　　 2.EPN的游離面不能支持人胚胎RPE細(xì)胞單層