埃他卡林對(duì)心肌和平滑肌ATP敏感性鉀通道基因表達(dá)的調(diào)節(jié)及其組織選擇性的研究.pdf

1、由內(nèi)向整流鉀通道Kir(inwardrectifierpotassiumchannel)亞基和磺酰脲類(lèi)受體SUR(sulfonylureareceptor)亞基構(gòu)成的ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitivepotassiumchannels，KATP)是新型抗高血壓藥物——鉀通道開(kāi)放劑(potassiumchannelopener,KCO)的作用靶點(diǎn)。但是，由于已有的鉀通道開(kāi)放劑缺乏明確的組織選擇性，雖然有效降壓但卻引發(fā)各種副反應(yīng)

2、，臨床上亟待新型鉀通道開(kāi)放劑類(lèi)化合物出現(xiàn)。埃他卡林(iptakalim，Ipt)不僅降壓作用確切、平穩(wěn)和持久，并且具在一定的選擇性作用特征：對(duì)心率影響輕；選擇性舒張小動(dòng)脈而對(duì)大動(dòng)脈的舒張作用無(wú)影響；不影響骨骼肌細(xì)胞KATP電流；在高血壓狀態(tài)下降壓作用強(qiáng)而不引起正常血壓的顯著下降，并逆轉(zhuǎn)高血壓心血管的結(jié)構(gòu)和功能重構(gòu)?；谝陨涎芯勘尘埃疚闹荚谔接懰幬镆l(fā)功能變化后的基因表達(dá)變化，從基因表達(dá)的角度研究藥物作用的特征，為揭示埃他卡林的組織選擇

3、性提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。 一、埃他卡林對(duì)正常血壓大鼠心肌、主動(dòng)脈和尾動(dòng)脈平滑肌KATP基因表達(dá)的調(diào)節(jié)利用反轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)研究埃他卡林對(duì)正常血壓大鼠(NTR)心血管組織中KATP亞基Kir6.1、Kir6.2、SUR1和SUR2基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。 與正常對(duì)照相比，埃他卡林和陽(yáng)性對(duì)照藥吡那地爾對(duì)心肌KATP亞基基因的表達(dá)無(wú)顯著影響(P＞0.05)。埃他卡林對(duì)主動(dòng)脈平滑肌KATP基因表達(dá)無(wú)顯著影響(P＞0.05)；

4、吡那地爾使主動(dòng)脈SUR2表達(dá)上升18.8％(P＜0.05)。尾動(dòng)脈平滑肌上，埃他卡林顯著抑制Kir6.1和Kir6.2基因的表達(dá)，比正常對(duì)照下降37.1％和29.1％(P＜0.05)；吡那地爾使Kir6.1和SUR2表達(dá)較正常對(duì)照下降31.1％和20.0％(P＜0.05)。以上結(jié)果表明，埃他卡林對(duì)心血管平滑肌KATP基因表達(dá)的影響具有組織選擇性，選擇性影響小動(dòng)脈平滑肌KATP的Kir6.1/Kir6.2基因表達(dá)而對(duì)心肌和大動(dòng)脈平滑肌KA

5、TP基因表達(dá)無(wú)影響；埃他卡林對(duì)大小動(dòng)脈平滑肌KATP基因表達(dá)的影響不同于吡那地爾，吡那地爾既可調(diào)節(jié)小動(dòng)脈又可調(diào)節(jié)大動(dòng)脈平滑肌KATP基因表達(dá)，具有顯著影響大小動(dòng)脈平滑肌SUR2基因表達(dá)變化的特征。 二、埃他卡林對(duì)高血壓大鼠心肌、主動(dòng)脈和尾動(dòng)脈平滑肌KATP基因表達(dá)的調(diào)節(jié)自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)分為兩組：模型組(未治療的SHR組)和埃他卡林治療組。以同年齡體重的WKY為正常對(duì)照組。 與WKY相比，SHR的心肌、主動(dòng)脈和尾

6、動(dòng)脈平滑SUR2和Kir6.2的基因表達(dá)顯著升高(P＜0.05)。與未治療的SHR相比，埃他卡林顯著降低三種組織中SUR2和Kir6.2的基因表達(dá)(P＜0.05)。三種組織中Kir6.1基因的表達(dá)在模型組和給藥治療組中均無(wú)顯著性變化(P＞0.05)。因此高血壓時(shí)心血管KATP基因表達(dá)的特征性變化表現(xiàn)為：心肌和大小動(dòng)脈平滑肌SUR2/Kir6.2基因表達(dá)的上行性調(diào)節(jié)，埃他卡林具有逆轉(zhuǎn)高血壓引起的SUR2和Kir6.2基因上行性表達(dá)的作用。

7、 三、埃他卡林對(duì)大鼠尾動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、蛋白激酶A和C活性的影響 血管的舒縮與血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)關(guān)系密切，且受蛋白激酶A(PKA)和C(PKC)活性的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)觀察埃他卡林對(duì)來(lái)源于大鼠尾動(dòng)脈的小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(RTA-SMCs)中[Ca2+]i、PKA和PKC活性等藥理學(xué)特征的影響，比較它與氰胍類(lèi)的吡那地爾和苯并噻二嗪類(lèi)的二氮嗪(diazoxide，Dia)的作用特征，進(jìn)一步探討埃他

8、卡林的選擇性作用機(jī)制。 1.埃他卡林對(duì)大鼠尾動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響埃他卡林由低至高濃度(0.1～10μmol·L-1)引起[Ca2+]i劑量依賴(lài)性降低(P＜0.05)。以KATP選擇性拮抗劑格列苯脲(glibenclamide，Gli，1μmol·L-1)預(yù)孵育，再連續(xù)給0.1和1μmol·L-1的埃他卡林，[Ca2+]i無(wú)顯著變化(P＞0.05)。同樣實(shí)驗(yàn)條件下，0.1～10μmol·L-1的吡那地爾引起[Ca2+]

9、i劑量依賴(lài)性降低(P＜0.05)，并被1μmol·L-1格列苯脲所拮抗。0.1μmol·L-1的二氮嗪對(duì)[Ca2+]i無(wú)影響(P＞0.05)，但1和10μmol·L-1引起[Ca2]i顯著降低(P＜0.05)，并被格列苯脲拮抗。以上結(jié)果表明：埃他卡林可濃度依賴(lài)性的降低小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度，并為格列苯脲所對(duì)抗；其作用的敏感性與吡那地爾相似，但比二氮嗪更敏感。 2.埃他卡林對(duì)尾動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞蛋白激酶A和C活性的影響與正常

10、對(duì)照相比，1μmol·L-1的埃他卡林使PKA、PKC活性升高36％和51％(P＜0.05)，吡那地爾使PKA、PKC活性升高39％和50％(P＜0.05)；二氮嗪對(duì)PKC有顯著影響，活性升高96％(P＜0.01)，但不影響PKA活性(P＞0.05)。因此埃他卡林對(duì)小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞PKA和PKC活性的影響與吡那地爾相似，但不同于二氮嗪。 四、埃他卡林對(duì)大鼠胃、回腸和膀胱平滑肌張力的影響在廣泛存在的非血管平滑肌中，埃他卡林對(duì)KAT

11、P的作用尚未研究。本實(shí)驗(yàn)采用離體張力實(shí)驗(yàn)觀察埃他卡林對(duì)胃、回腸和膀胱平滑肌張力的影響，并與吡那地爾和二氮嗪進(jìn)行比較研究，揭示埃他卡林在非血管平滑肌上的組織選擇性特征。 乙酰膽堿(10μmol·L-1)預(yù)收縮各離體標(biāo)本，達(dá)最大幅度后再累積加入不同濃度的埃他卡林(0.01～100μmol·L-1)，回腸、胃和膀胱張力無(wú)變化。相同實(shí)驗(yàn)條件下，二氮嗪對(duì)三種組織張力也無(wú)影響。吡那地爾對(duì)胃和膀胱張力無(wú)影響，但是在回腸平滑肌上，吡那地爾10和

12、100μmol·L-1引發(fā)的舒張率分別為28％和52％，顯著拮抗乙酰膽堿誘發(fā)的收縮反應(yīng)，引發(fā)明顯的舒張作用。以上結(jié)果表明，埃他卡林對(duì)胃、回腸和膀胱等非血管平滑肌張力無(wú)影響，其作用特征與二氮嗪相似，但與吡那地爾不同；吡那地爾雖然對(duì)胃和膀胱平滑肌張力無(wú)影響，但具有擴(kuò)張回腸平滑肌的作用。 五、埃他卡林對(duì)大鼠胃、回腸和膀胱平滑肌KATP基因表達(dá)的影響胃、回腸平滑肌的KATP亞型主要是SUR2和Kir6.1，膀胱平滑肌主要是SUR2和Ki

13、r6.2。與正常對(duì)照相比，埃他卡林和吡那地爾對(duì)胃和回腸KATP基因表達(dá)的影響無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；埃他卡林使膀胱SUR2基因表達(dá)降低41％(P＜0.05)，Kir6.2基因表達(dá)升高43％(P＜0.05)，而吡那地爾只使SUR2基因表達(dá)降低44％(P＜0.05)。以上結(jié)果表明：埃他卡林和吡那地爾均不影響胃和回腸平滑肌KATP的基因表達(dá)，而選擇性調(diào)節(jié)膀胱平滑肌KATP的基因表達(dá)，但兩者的調(diào)節(jié)方式不同：埃他卡林下行性調(diào)節(jié)SUR2基因和

14、上行性調(diào)節(jié)Kir6.2的基因表達(dá)；吡那地爾不影響Kir6.2的基因表達(dá)，只下行性調(diào)節(jié)膀胱平滑肌SUR2的基因表達(dá)。 綜上所述，本研究結(jié)論如下：1.埃他卡林對(duì)心血管KATP基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用具有選擇性：選擇性下行性調(diào)節(jié)小動(dòng)脈KATP基因表達(dá)；不影響心肌和大動(dòng)脈平滑肌KATP的基因表達(dá)表達(dá)。2.埃他卡林對(duì)心血管KATP基因表達(dá)的選擇性調(diào)節(jié)作用不同于吡那地爾：選擇性下行性調(diào)節(jié)小動(dòng)脈平滑肌Kir6.1/Kir6.2的基因表達(dá)；但吡那地爾

15、對(duì)大小動(dòng)脈平滑肌KATP的基因表達(dá)均有調(diào)節(jié)作用，具有上行性調(diào)節(jié)大動(dòng)脈平滑肌SUR2基因表達(dá)和下行性調(diào)節(jié)小動(dòng)脈平滑肌SUR2/Kir6.1基因表達(dá)的特征。3.高血壓時(shí)心血管KATP基因表達(dá)的特征性變化表現(xiàn)為心肌和大小動(dòng)脈平肌SUR2/Kir6.2的上行性調(diào)節(jié)，并可被埃他卡林所逆轉(zhuǎn)。4.埃他卡林對(duì)小動(dòng)脈平滑肌的藥理學(xué)作用包括降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，提高PKA和PKC的活性，其作用特征不同于二氮嗪，二氮嗪不影響PKA的活性。5.埃他卡林不影響胃