兒童白血病病人特異性誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)樣細胞株的建立及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　急性白血病是兒童時期最常見的血液系統(tǒng)腫瘤，約占該時期所有惡性腫瘤的35％。隨著危險分組治療的開展、化療方案的進步和支持治療的改善，ALL長期無病生存率可達70％～80％，而AML的長期無病生存率可達50％左右[1-3]。但仍有部分病例早期復(fù)發(fā)或治療失敗，HSCT是該部分患者的最佳選擇。但造血干細胞移植的成敗與HLA的配型密切相關(guān)，如果HLA不相合，便可能會發(fā)生嚴重的排異反應(yīng)，甚至危及生命。目前國際上推薦首選H

2、LA匹配相關(guān)供者的HSCT，但由于80％的兒童白血病患者缺少這種供者，auto-HSCT也被選擇性地應(yīng)用于白血病的治療。auto-HSCT的不足之處是白血病的復(fù)發(fā)率高，移植治療后復(fù)發(fā)的原因主要是自體移植物中殘余的白血病細胞(其中還可能包括極少量的白血病干細胞)隨著移植物再次輸入人體內(nèi)以及移植后無移植物抗白血病(GVL)效應(yīng).為此，尋找一種全新的非腫瘤細胞來源的自體干細胞進行移植對于降低移植后白血病復(fù)發(fā)具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用前景。<

3、br>　　iPSCs細胞具有類似于ESCs的多向分化特性，在特定的誘導(dǎo)條件下既可向造血干/祖細胞分化，也可向成熟的血細胞如紅細胞、單核細胞和NK細胞等分化。為此，誘導(dǎo)產(chǎn)生白血病病人特異性的iPSCs或許將對白血病的治療帶來新的突破。
　　要成功地誘導(dǎo)產(chǎn)生病人特異性的iPSCs，應(yīng)考慮如下幾個問題：(1)選用合適的載體；(2)選用最適的轉(zhuǎn)錄因子；(3)適合重編程的靶細胞；(4)選用合適的能維持干細胞特性和促使干細胞分化的培養(yǎng)基。

4、r>　　通過病毒載體導(dǎo)入外源基因進行體細胞重編程獲得iPSCs是目前最為常用的方法。盡管如此，病毒介導(dǎo)的重編程方法由于外源性基因和病毒骨架序列會永久地整合于靶細胞基因組內(nèi)，并且轉(zhuǎn)基因的反式激活會最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生而限制了其臨床應(yīng)用[23]。通過非病毒的方式或使用非整合的載體導(dǎo)入外源基因?qū)Ⅲw細胞誘導(dǎo)為iPSCs已經(jīng)取得成功[24-27]。盡管如此，體細胞重編程至今尚無普適性的載體。
　　鑒于需要導(dǎo)入一定數(shù)量的轉(zhuǎn)錄因子基因后方能有效地

5、進行體細胞重編程，為此，目前有許多關(guān)于不同轉(zhuǎn)錄因子組合進行體細胞重編程的研究。iPSCs最先是通過逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入4個轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、Sox2，Klf4和cMyc或Oct4、Sox2、Lin28和Nanog)誘導(dǎo)產(chǎn)生的[4-6]后來，導(dǎo)入3個轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、Sox2和Klf4)或2個轉(zhuǎn)錄因子(Oct4和Sox2或Klf4)甚至單個轉(zhuǎn)錄因子(Oct4)即可成功誘導(dǎo)產(chǎn)生iPSCs亦可見報道[28-32]，但未見采用單個Oct4基因?qū)?/p>

6、能獲得人類iPSCs的報道?？梢奜ct4是體細胞誘導(dǎo)iPSCs所不可或缺的轉(zhuǎn)錄因子。
　　選擇合適的靶細胞進行重編程是另一個非常重要的問題。這些靶細胞應(yīng)當易于獲得和易于在體外培養(yǎng)增殖。這些細胞包括淋巴細胞，單核細胞、NK細胞以及來自于外周血或皮膚的成纖維細胞、來自骨髓的間充質(zhì)干細胞以及來自血管的內(nèi)皮細胞等。將人臍血來源的內(nèi)皮細胞(endothelial cell，ECs)、動員的外周血干/祖細胞以及非動員的外周血T淋巴細胞等重編程

7、誘導(dǎo)產(chǎn)生iPSCs已有報道[15-17]。盡管如此，目前有關(guān)將來源于白血病病人的體細胞重新編程后獲得iPSCs方面的文獻鮮有報道，尤其利用兒童白血病病人體細胞進行重編程研究則未見報道。MUELLER LP等研究表明從化療后的骨髓標本中同樣可分離到足夠數(shù)量且符合臨床應(yīng)用的間充質(zhì)干細胞(mesanchymal stem cells，MSCs)[22]?？梢?，將白血病病人骨髓來源的MSCs作為誘導(dǎo)產(chǎn)生病人特異性的iPSCs的靶細胞不無可能。<

8、br>　　本研究試圖將白血病病兒骨髓來源的MSCs重編程成為iPSCs，分析其生物學(xué)特性，探索其向CD34+和/或CD45+的細胞分化的可能性及方法，并盼望通過該研究能為將來白血病的個體化治療提供新的治療方法。
　　本研究主要包括以下三個部分：(1)iPSCs相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因在白血病細胞中的表達、基因的克隆及載體構(gòu)建；(2)人骨髓間充質(zhì)干細胞(hBM-MSCs)的培養(yǎng)、鑒定及生物學(xué)特性分析；(3)hBM-MSCs來源的iPSCs樣

9、細胞株的建立及其生物學(xué)特性鑒定。
　　方法:
　　1 iPSCs相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因在白血病細胞中的表達、基因的克隆及載體構(gòu)建
　　1.1 iPSCs相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因在白血病細胞株及白血病細胞中的表達譜研究：通過RT-PCR和Real-Time PCR檢測9個白血病細胞株包括KGla，Meg-01，HL-60，K562，U937，Molt-3，Molt-4，Nalm-6和Raji以及53例白血病標本中iPSCs相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子

10、基因(包括Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28和Nanog)的表達情況.經(jīng)知情同意將取自9例ITP病人的骨髓標本作為對照。
　　1.2誘導(dǎo)多能干細胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及序列分析：根據(jù)基因表達譜研究結(jié)果，設(shè)計包含酶切位點的引物，通過RT-PCR擴增各轉(zhuǎn)錄因子基因的ORF序列，經(jīng)測序比對后，將序列克隆至pGEM(R)-T載體。
　　1.3誘導(dǎo)多能干細胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因真核表達載體的構(gòu)建：通過酶切、連接反應(yīng)，將

11、克隆至pGEM(R)-T載體的序列插入至真核表達載體pcDNA3.1。
　　2入骨髓間充質(zhì)干細胞(hBM-MSCs)的培養(yǎng)、鑒定及生物學(xué)特性分析
　　2.1 hBM-MSCs的培養(yǎng)和鑒定：通過全骨髓培養(yǎng)和密度梯度離心相結(jié)合的方法分離獲得MSCs，采用流式細胞術(shù)檢測MSCs表面抗原的表達情況。
　　2.2 hBM-MSCs的類ESCs生物學(xué)特性分析：通過RT-PCR和Real-Time PCR檢測檢測MSCs中iPSCs

12、相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因表達；通過流式細胞術(shù)和免疫熒光法檢測MSCs中多能性標記物如SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81等的表達情況。
　　3 hBM-MSCs來源的iPSCs樣細胞株的建立及其生物學(xué)特性鑒定
　　3.1穩(wěn)定表達Oct4蛋白的hBM-MSCs細胞的建株：將真核表達載體pcDNA3.1/Oct4轉(zhuǎn)染MSCs，通過多輪亞克隆篩選出穩(wěn)定表達Oct4的細胞株；通過RT-PCR、Real Time PCR、免疫熒光法

13、、流式細胞術(shù)和Western Blot檢測Oct4的表達。
　　3.2穩(wěn)定表達Oct4蛋白的MSCs(MSCs-Oct4)的生物學(xué)特性研究：通過免疫熒光法和流式細胞術(shù)檢測MSCs-Oct4細胞中ESCs多能性標志物的表達情況；通過RT-PCR和Real Time PCR檢測MSCs-Oct4細胞中Nanog和Sox2基因的表達。
　　3.3不同轉(zhuǎn)錄因子組合瞬時共轉(zhuǎn)染MSCs的轉(zhuǎn)染效率分析：分成4種不同的轉(zhuǎn)錄因子組合(均含定位

14、蛋白GFP)，連續(xù)兩次瞬時共轉(zhuǎn)染MSCs，流式檢測瞬時轉(zhuǎn)染時ESCs多能性標志物的表達情況；通過定位蛋白的表達情況比較不同組合的轉(zhuǎn)染效率。
　　3.4 hBM-MSCs來源的iPSCs樣細胞的鑒定及其生物學(xué)特性研究：免疫熒光法，流式細胞術(shù)和Western Blot檢測ESCs多能性標志物的表達情況；通過堿性磷酸酶染色、端粒酶活性、擬胚體形成和畸胎瘤形成試驗鑒定MSCs來源的iPSCs樣細胞的生物學(xué)特性。
　　3.5 MSCs

15、來源的iPSCs樣細胞向造血系細胞定向分化：在特定造血生長因子包括IL-3，IL-6，F(xiàn)lt-3 Ligand，SCF，G-CSF和BMP4的作用下，誘導(dǎo)MSCs來源的iPSCs樣細胞向CD34+和/或CD45+的細胞分化，流式檢測CD34+和/或CD45+的表達陽性率，RT-PCR檢測CD34和/或CD45基因的表達。
　　結(jié)果:
　　1 iPSCs相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因在白血病細胞中的表達，基因的克隆及載體構(gòu)建
　　1.

16、1 iPSCs相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因在白血病細胞中的表達譜研究：RT-PCR結(jié)果表明，9/9個細胞株表達cMyc和Lin28基因；3/9細胞株(U937，K562和HL60)表達Klf4基因；2/9細胞株(Molt-3和K562)表達Oct4基因；2/9細胞株(KG1a和Meg-01)表達Nanog基因；3/9細胞株(KG1a、Meg-01和Raji)低水平表達Sox2基因。53/53例標本中檢測到cMyc基因表達，16/53例標本中檢測到K

17、lf4表達，20/53例標本中檢測到Lin28低水平表達，11/53例標本中檢測到Sox2、低水平表達，7/53例標本中檢測Oct4極低水平表達，3/53例標本中檢測到Nanog基因表達。
　　Real Time PCR結(jié)果顯示，與對照組(N=9)相比，白血病細胞株組(N=9)cMyc基因表達上調(diào)(P=0.012)，而Klf4(P=0.001)和Sox2基因(P=0.010)則表達下調(diào)，兩組間差異具有顯著意義.而Nanog(P=0

18、.08)、Lin28(P=0.882)和Oct4基因(P=0.456)的表達兩組間差異無顯著性。iPSCs相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因包括cMyc、Klf4、Lin28、Nanog、Oct4和Sox2在白血病細胞株中的平均相對表達量分別為4.63±8.51％、0.45±0.51％、0.014±0.023％、0.004±0.006％、0.083±0.085％和0.45±0.51％。髓系和淋系細胞株在cMyc(P=0.063)、Klf4(P=0.111

19、)和Sox2(P=0.286)三個基因的表達量方面無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　與對照組(N=9)相比，白血病組(N=53)cMyc表達上調(diào)(P=0.001)，而Klf4(P=0.04)則表達下調(diào)。Sox2(P=0.266)、Nanog(P=0.237)，Lin28(P=0.769)和Oct4基因(P=0.93)的表達，對照組和白血病細胞組間差異無顯著性。iPSCs相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因包括cMyc、Klf4、Lin28、Nanog、Oct4和S

20、ox2在白血病細胞株中的平均相對表達量分別為3.49±3.78％、0.83±0.38％、0.33±1.29％、0.83±0.38％、0.009±0.036％和0.83±0.38％。AML(N=26)和ALL(N=27)兩組在cMyc(P=0.803)和Klf4(P=0.098)兩個基因的表達量方面也無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　1.2 iPSCs相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及序列分析：分別以KG1a、Nalm-6和Meg-01細胞cDNA為模板，

21、均可擴增出1320bp左右的單一cMyc基因條帶和630bp左右單一Lin28基因條帶，相應(yīng)的PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后與理論序列完全吻合；分別以KG1a和Meg-01細胞eDNA為模板，均可擴增出918bp左右的單一Nanog基因條帶，送測序發(fā)現(xiàn)存在6個堿基突變，其中3個無意突變，3個有意突變；以U937細胞cDNA為模板，擴增出1413bp左右的單一Klf4基因條帶，PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后與理論序列完全吻合；以畸胎瘤eDNA為模板，擴增出954

22、bp左右的單一Sox2基因條帶，PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后與理論序列完全吻合；分別以肝臟組織和睪丸腫瘤cDNA為模板，均可擴增出1083 bp左右的單一Oct4基因條帶，測序發(fā)現(xiàn)有很多堿基突變.通過SOE的方法將Nanog基因中的3個有意突變進行了回復(fù)突變。通過TA克隆系統(tǒng)將上述測序正確的各轉(zhuǎn)錄因子基因克隆至pGEM(R)-T載體。
　　1.3 iPSCs相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因賓核表達載體的構(gòu)建：通過酶切、連接反應(yīng)，將克隆至pGEM(R)-T載

23、體的各轉(zhuǎn)錄因子基因插入至真核表達載體pcDNA3.1。通過人工合成的方法合成Oct4序列，并將其插入至真核表達載體pcDNA3.1和peGFP-N1，經(jīng)測序，插入的各轉(zhuǎn)錄因子基因序列完全正確。
　　2入骨髓間充質(zhì)干細胞(hBM-MSCs)的培養(yǎng)、鑒定及生物學(xué)特性分析
　　2.1 hBM-MSCs的培養(yǎng)和鑒定：流式結(jié)果表明，第10代之前的hBM-MSCs均強表達CD29，CD105，CD166和CD44，共檢測3次，平均陽性率

24、分別為95.89±2.20％，97.40±1.56％，96.94±1.45％和95.67±0.89％；第5代之前的hBM-MSCs均較強表達CD90，平均陽性率為93.88±5.08％，P5代后的hBM-MSCs弱表達CD90，hBM-MSCs不表達CD34，CD38，CD14，CD19和HLA-DR，其平均陽性率均<5％。
　　2.2 hBM-MSCs的類ESCs生物學(xué)特性分析：PCR結(jié)果顯示，MSCs僅內(nèi)源性表達Sox2基因；

25、免疫熒光和流式結(jié)果顯示內(nèi)源性表達Sox2，其表達平均陽性率為16.70％。極低表達ESCs其它的多能標志物Oct4、Nanog、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81(其平均陽性率不到5％)。
　　3 hBM-MSCs來源的iPSCs樣細胞株的建立及其生物學(xué)特性鑒定
　　3.1穩(wěn)定表達Oct4蛋白的hBM-MSCs細胞(MSCs-Oct4)的建株：3輪亞克隆后Oct4的表達陽性率分別為49.99％、70.75％和94

26、.66％，而對照組MSCs其Oct4的表達陽性率為1.72％；免疫熒光顯示胞核內(nèi)Oct4的表達，Western Blot顯示MSCs-Oct4細胞存在大小約為45kDa的蛋白條帶。Real-Time PCR結(jié)果顯示，MSCs-Oct4細胞(轉(zhuǎn)染68d后)內(nèi)源性O(shè)ct4和總Oct4基因的相對mRNA表達量分別是未轉(zhuǎn)染MSCs細胞的6.23和7.20倍。
　　3.2 MSCs-Oct4的生物學(xué)特性研究：流式結(jié)果顯示，MSCs-Oct4

27、細胞其Nanog和Sox2的平均表達水平分別從未轉(zhuǎn)染時的0.61％和12.33％增加至40.61％和96.21％；SSEA-4，TRA-1-60及TRA-1-81的表達陽性率分別從未轉(zhuǎn)染時的8.21％、1.72％和2.53％增加至90.77％、64.62％和71.70％。Real-Time PCR結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染的MSCs細胞相比較，hBM-MSCs-Oct4細胞其Nanog和Sox2的相對mRNA表達量分別增加了8.68和2.13倍

28、；免疫熒光顯示胞核內(nèi)Nanog和Sox2的表達。
　　3.3不同轉(zhuǎn)錄因子組合瞬時共轉(zhuǎn)染MSCs的轉(zhuǎn)染效率分析：隨著轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目的增加，轉(zhuǎn)染效率逐漸下降；僅轉(zhuǎn)染一個轉(zhuǎn)錄因子(1TF)時綠色熒光最強，6個轉(zhuǎn)錄因子(6TF)共轉(zhuǎn)染時熒光最弱。6TF、5TF、3TF和1TF瞬時共轉(zhuǎn)染hBM-MSCs時多能性標志物SSEA-4的表達陽性率分別為86.10％、74.16％、75.79％和89.41％；TRA-1-60的表達陽性率分別為32.6

29、6％、33.20％、38.55％和42.77％；TRA-1-81的表達陽性率分別為17.24％、39.25％、34.07％和64.97％。
　　3.4 hBM-MSCs來源的iPSCs樣細胞的鑒定及其生物學(xué)特性研究：MSCs來源的iPSCs樣細胞邊界清晰，核質(zhì)比高，堿性磷酸酶染色和端粒酶活性檢測均陽性；體外培養(yǎng)時可形成擬胚體，表達三個胚層的基因SPARC、Brachyury、TBX20、TUBB3和WNT1；分化第21天時多能性標

30、志物SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81表達陽性率分別從90.77％、64.62％和71.70％降至4.25％、3.07％和1.69％。MSCs來源的iPSCs在裸鼠體內(nèi)能產(chǎn)瘤，瘤體切片HE染色顯示為未分化的干細胞。
　　3.5 MSCs來源的iPSCs樣細胞向造血系細胞定向分化：MSCs來源的iPSCs樣細胞在造血生長因子包括IL-3，IL-6，F(xiàn)lt-3 Ligand，SCF，G-CSF和BMP4的作用下，能向CD

31、34+和CD45+的細胞分化，分化培養(yǎng)第20天其表達陽性率分別為26.22％和26.03％；RT-PCR檢測到CD34和CD45的基因條帶；甲基纖維素半固體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)14時觀察到CFU-GM樣的集落形成。
　　結(jié)論:
　　1、成功地將兒童白血病骨髓MSCs誘導(dǎo)成為具有多能性的iPSCs樣細胞；
　　2、單個Oct4轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染MSCs能有效上調(diào)Nanog和Sox2的表達，并能誘導(dǎo)人iPSCs樣細胞的產(chǎn)生；