營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白對(duì)林業(yè)害蟲(chóng)的活性測(cè)定和植物表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bt)是世界上應(yīng)用面積最廣、研究最為深入、應(yīng)用最成功殺蟲(chóng)微生物。營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白(vips)是一類(lèi)BT在營(yíng)養(yǎng)期分泌的新型殺蟲(chóng)蛋白。本論文分析了營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白Vip3A對(duì)鱗翅目林木害蟲(chóng)的生物活性，構(gòu)建了vip3A(a)基因植物表達(dá)載體，對(duì)植物轉(zhuǎn)化方面進(jìn)行了研究。 1.Bt營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白對(duì)鱗翅目林木害蟲(chóng)生物活性研究Bt產(chǎn)生的伴孢晶體蛋白(ICPs)對(duì)多種農(nóng)林重要害蟲(chóng)有很高的生物活性，營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白是一類(lèi)與BT伴孢晶體蛋

2、白殺蟲(chóng)機(jī)理不同的新型蛋白，vip3A蛋白對(duì)多種重要農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)有活性，而該類(lèi)蛋白對(duì)林木重要害蟲(chóng)美國(guó)白蛾和楊扇舟蛾的生物活性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。 本實(shí)驗(yàn)利用本實(shí)驗(yàn)室克隆的蘇云金芽孢桿菌Vip3A-LS1和Vip3A-LS8基因，構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pPV113和pPV116，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE分析均檢測(cè)出約88kD的Vip3A蛋白。生物學(xué)活性檢測(cè)結(jié)果表明，重組蛋白對(duì)初孵美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)和楊扇舟蛾

3、初孵幼蟲(chóng)均有較高的殺蟲(chóng)活性，當(dāng)用80μg/g(蛋白/飼料)的vip3A-LS1蛋白處理初孵美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)時(shí)，平均校正死亡率達(dá)到(53.02±0.43)％，體重抑制率達(dá)到了80.60％，對(duì)楊扇舟蛾初孵幼蟲(chóng)平均校正死亡率達(dá)到(68.00±0.60)％；同濃度的Vip3A-LS8蛋白對(duì)初孵美國(guó)白蛾平均校正死亡率達(dá)(52.12±0.53)％，體重抑制率高達(dá)78.90％，對(duì)楊扇舟蛾初孵幼蟲(chóng)平均校正死亡率達(dá)到(70.0±0.53)％，首次發(fā)現(xiàn)Vip3

4、A蛋白對(duì)林木重要害蟲(chóng)有較高殺蟲(chóng)活性。 2.Vip3A(a)轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建和植物轉(zhuǎn)化研究生物農(nóng)藥雖然對(duì)環(huán)境的負(fù)面影響較少，但也存在防治效果較差、不穩(wěn)定等缺陷。隨著植物基因工程研究的深入，通過(guò)基因工程改造獲得抗蟲(chóng)植物已經(jīng)成為生物防治熱點(diǎn)，其中Bt基因在林木特別是楊樹(shù)的轉(zhuǎn)化已有成功報(bào)道。為克服靶試?yán)ハx(chóng)對(duì)單-基因表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)生抗性，多基因或者不同抗蟲(chóng)機(jī)制基因的轉(zhuǎn)化已經(jīng)成為相關(guān)研究的熱點(diǎn)。本研究擬將Vip3A(a)基因通過(guò)農(nóng)桿菌介

5、導(dǎo)方式轉(zhuǎn)化含有CrylA和ApIA雙抗蟲(chóng)基因的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)，研究轉(zhuǎn)化子的抗蟲(chóng)性，以及轉(zhuǎn)化子在基因和表達(dá)產(chǎn)物水平的協(xié)同效應(yīng)。 以重組質(zhì)粒pPV113和pPV116為模板，根據(jù)已發(fā)表的Vip3A(a)基因序列，參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增出一條大約2.37kb目的片斷，將其目的片斷插入植物表達(dá)載體pB1121，把pB1121上的表達(dá)框架插入pCAU1302的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建了p1302PI113和p1302PI116兩個(gè)表達(dá)載體。