ACEI及AT-,1-受體拮抗劑干預(yù)肺切除加野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓肺血管重構(gòu)作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：觀察ACEI和AT<,1>受體拮抗劑對(duì)大鼠肺切除加野百合堿誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓肺血管重構(gòu)的影響，進(jìn)而探討AngⅡ在肺動(dòng)脈高壓肺血管重構(gòu)的機(jī)制。 方法： 1．ACEI和AT<,1>受體拮抗劑對(duì)大鼠肺高壓肺血管重構(gòu)影響的研究。 1.1 大鼠肺高壓模型的建立：用大鼠左肺切除加皮下注射野百合堿建立肺高壓模型并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察：觀察其平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)、新生內(nèi)膜形成以及心室重量即右心室/左心室+室間膈(RV/LV+S)

2、的變化；免疫組化法比較肺血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-actin)表達(dá)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)、肺小動(dòng)脈中膜厚度百分比、肺小動(dòng)脈新生內(nèi)膜增殖度和平均血管阻塞計(jì)分(VOS)。 1.2 ACEI和AT<,1>受體拮抗劑對(duì)大鼠肺高壓肺血管基質(zhì)重構(gòu)影響：用ACEI(卡托普利captopril)和AT<,1>受體拮抗劑(氯沙坦losartan)分別進(jìn)行干預(yù)，免疫組化檢測(cè)肺組織基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、

3、9和其組織特異抑制物-1(TIMP-1)；應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測(cè)MMP-2、9、TIMP-1、α1-Ⅰ型膠原(Collagen Ⅰ-α1)、α1 Ⅳ型膠原(CollagenⅣ-α1)、內(nèi)源性血管彈性蛋白酶(EVE)和韌粘素C(TN-C)mRNA在肺組織中的表達(dá)；明膠酶譜法(zymography)檢測(cè)MMP-2、9在肺組織中的活性；苦味酸-天狼猩紅染色觀察膠原在肺組織的分布與含量。 1.3 ACEI和AT<,1>受體拮

4、抗劑對(duì)大鼠肺組織細(xì)胞凋亡影響：TUNEL法比較各組細(xì)胞凋亡變化，免疫組化法比較凋亡相關(guān)基因bax、bcl-2變化。 2. AngⅡ?qū)Υ笫蠓蝿?dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)影響及洛沙坦干預(yù)的研究。 2.1 大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)：采用組織貼塊法進(jìn)行大鼠PASMC原代培養(yǎng)，用4-6代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。 2.2 AngⅡ?qū)ASMC MMPs、TIMP-1和膠原mRNA的影響：MTT法確定AngⅡ最佳作用濃度(1x10<'-

5、8>M)，應(yīng)用AngⅡ刺激細(xì)胞并用氯沙坦干預(yù)，以不同時(shí)間點(diǎn)(1h、3h、12h、24h)分組，應(yīng)用FQ-PCR檢測(cè)PASMC中MMP-2、9、TIMP-1、Collagen Ⅰ-α 1、Collagen Ⅳ-α 1 mRNA表達(dá)。 2.3 AngⅡ?qū)ASMC增殖與凋亡的影響：分別以不同AngⅡ濃度梯度(1x10<'-9>M、lx10<'-8>M、1x10<'-7>M)和不同作用時(shí)間點(diǎn)(8h、12h、24h、48h)分組，均設(shè)空

6、白對(duì)照組，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞增殖與凋亡。 結(jié)果： 1.左肺切除加野百合堿導(dǎo)致了大鼠嚴(yán)重肺高壓形成，并出現(xiàn)新生內(nèi)膜，該組mPAP、右心室重量、小動(dòng)脈肌化程度、肺小動(dòng)脈中膜厚度百分比、肺小動(dòng)脈新生內(nèi)膜增殖度和平均血管阻塞計(jì)分較其它各組顯著升高(P<0.05)。 2.肺高壓模型組肺組織MMP-2、9、TIMP-1、EVE、TN-C及Collagen Ⅰ-α 1、Collagen Ⅳ-α1 mRNA表達(dá)較其

7、它各組顯著升高(P<0.05)，卡托普利和洛沙坦組上述各指標(biāo)較模型組均下降(P<0.05)。 3.模型組肺血管細(xì)胞凋亡較正常對(duì)照組增加(P<0.05)，干預(yù)組細(xì)胞凋亡較模型組減少(P(0.05)。 4．AngⅡ誘導(dǎo)PASMC增殖，于12h達(dá)高峰；同時(shí)誘導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡，于24h達(dá)高峰；氯沙坦干預(yù)組細(xì)胞增殖減少同時(shí)細(xì)胞凋亡亦減少。 5．AngⅡ誘導(dǎo)PASMC MMP-2、9、TIMP-1、Collagen Ⅰ

8、-α 1、CollagenⅣ-α 1 mRNA表達(dá)；氯沙坦干預(yù)組使上述指標(biāo)的mRNA表達(dá)下降(P<0.05)。 結(jié)論： 1．左肺切除加野百合堿導(dǎo)致了大鼠肺血管重構(gòu)、嚴(yán)重肺高壓形成； 2．AngⅡ在肺高壓肺血管重構(gòu)中的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)成分的改變有關(guān)； 3．ACEI和AT<,1>受體拮抗劑可通過(guò)干預(yù)ECM重構(gòu)以及影響增殖與凋亡，有效抑制大鼠肺動(dòng)脈高壓肺血管重構(gòu)，降低肺動(dòng)脈壓力；