miR-150抑制肝星狀細(xì)胞LX-2激活的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 微小RNAs(microRNAs，miRNAs)通過與靶基因的3'非翻譯區(qū)(Untranslatedregion，UTR)以堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式控制基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯進(jìn)程。近來，越來越多的文獻(xiàn)證實(shí)微小RNAs與肝纖維化進(jìn)程密切相關(guān)。有報(bào)道顯示miR-150可以通過抑制其已知靶點(diǎn)C-myb的表達(dá)進(jìn)而抑制肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)的激活及減少細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如Ⅰ型膠原的產(chǎn)生。然而

2、，我們發(fā)現(xiàn)減少的C-myb表達(dá)并不能一一對(duì)應(yīng)由miR-150引起的所有現(xiàn)象。我們推測(cè)miR-150對(duì)HSCs的抑制可能存在其它潛在的分子機(jī)制。
　　 目的：
　　 本研究通過構(gòu)建TGF-β1誘導(dǎo)人肝星狀細(xì)胞LX-2激活的體外模型，觀測(cè)肝纖維化相關(guān)的目的miRNA，即miR-150的表達(dá)改變;并進(jìn)一步確證其與TGF-β1刺激是否存在濃度和時(shí)間依賴性。恢復(fù)LX-2中miR-150濃度對(duì)LX-2是否存在抑制以及細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)

3、改變情況，并最終探討miR-150抑制TGF-β1激活的LX-2的分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.研究模型:采用不同的TGF-β1濃度(0 ng/ml，0.1 ng/ml，0.5 ng/ml和2ng/ml)刺激LX-2，并檢測(cè)Col1A1的含量確證肝纖維化體外研究模型的建立。
　　 2.miR-150的確證:采用real-time PCR法檢測(cè)不同時(shí)間（0h，24h，48h和72h）和不同濃度（0 ng/ml

4、，0.1 ng/ml，0.5 ng/ml和2 ng/ml）TGF-β1刺激下miR-150表達(dá)含量的改變。
　　 3.過表達(dá)的miR-150對(duì)LX-2的影響:分別采用MTT法、ELISA細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)miR-150模擬物（miR-150 mimics）轉(zhuǎn)染后的LX-2細(xì)胞的增殖活力和細(xì)胞凋亡率;同時(shí)，采用real-time PCR和western blot法檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白Ⅰ型膠原和α-SMA的mRNA及蛋白表達(dá)改

5、變。
　　 4.使用TargetScan Human Release6.2軟件預(yù)測(cè)miR-150的靶基因，并采用熒光素報(bào)告基團(tuán)實(shí)驗(yàn)確證。
　　 結(jié)果：
　　 1.體外模型的建立:0 ng/ml，0.1 ng/ml，0.5 ng/ml和2 ng/ml不同TGF-β1濃度刺激下LX-2的Col1A1含量成劑量依賴性增加(P＜0.05)。
　　 2.miR-150的確證:當(dāng)TGF-β1濃度由0 ng/ml增加到

6、2 ng/ml時(shí)，miR-150表達(dá)含量為濃度依賴性下調(diào)(P＜0.05);當(dāng)0.1 ng/ml TGF-β1分別作用0h、24h、48h和72h時(shí)，miR-150表達(dá)含量呈現(xiàn)為時(shí)間依賴性下調(diào)（P＜0.05）。
　　 3.過表達(dá)miR-150的影響:隨著miR-150含量的恢復(fù)，LX-2細(xì)胞中Ⅰ型膠原和α-SMA的mRNA及蛋白明顯下降(P＜0.05);與對(duì)照組相比，miR-150過表達(dá)組的增殖率明顯受到抑制，僅為62.1％(P＜

7、0.05)，但凋亡率卻無任何改變(P＞0.05)。
　　 4.利用TargetScan發(fā)現(xiàn)miR-150種子序列與Col4A4和Sp1 mRNA的3'UTR區(qū)可以互補(bǔ)配對(duì)，且物種間的保守性較高;構(gòu)建含待測(cè)靶基因Col4A4或Sp1的報(bào)告質(zhì)粒后，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-150前體組中熒光素活性均明顯下調(diào)(P＜0.05)。同時(shí)，構(gòu)建含Col4A4或Sp1突變序列的報(bào)告質(zhì)粒，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-150前體組中熒光素活性并無明顯

8、變化(P＞0.05)。
　　 5.與對(duì)照組相比，在過表達(dá)miR-150的LX-2細(xì)胞中Sp1的上游通路分子Smad2，p-Smad2，Smad3和p-Smad3均未有改變。
　　 結(jié)論：
　　 1.miR-150存在明顯的抗纖維化作用，可以減少LX-2細(xì)胞的增殖，但不涉及其凋亡的改變。
　　 2.miR-150可以通過其靶點(diǎn)Sp1和Col4A4分別降解Ⅰ型和Ⅳ型膠原含量，而這一過程并未涉及TGF-β/Sm