葛根素通過(guò)細(xì)胞凋亡途徑干預(yù)帕金森病模型的研究.pdf

1、安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文葛根素通過(guò)細(xì)胞凋亡途徑干預(yù)帕金森病模型的研究姓名：程月發(fā)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：藥理學(xué)指導(dǎo)教師：陳志武;李慶林20090401安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 4 細(xì)胞的凋亡過(guò)程中的作用；通過(guò)給予 6 - O H D A 單側(cè)注射損毀黑質(zhì)神經(jīng)元建立 P D 大鼠模型，研究葛根素對(duì) P D 模型大鼠的影響，進(jìn)一步探討葛根素的作用機(jī)制。 2方法 2 . 1臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞存活率和形態(tài)學(xué)觀察 葛根素預(yù)處理后培養(yǎng)的 S H

2、- S Y 5 Y 細(xì)胞和 1 m MM P P + 作用 4 8h 后臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中分組如下：空白對(duì)照組、模型組（1 m MM P P + 組）和不同濃度的葛根素藥物組（1 2 . 5μMp u e r a r i n + 1 m MM P P + 組，2 5μMp u e r a r i n + 1 m MM P P + 組，5 0μMp u e r a r i n + 1 m MM P P + 組）。 2 . 2J C -

3、 1 流式細(xì)胞檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位 葛根素造模 2 4 h 后進(jìn)行 J C - 1 染色，流式細(xì)胞儀分析。 2 . 3E L I S A 檢測(cè)胞漿細(xì)胞色素 C 的含量 各組細(xì)胞培養(yǎng) 24 小時(shí)，達(dá)到密度為 2x106 cells/ml。ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞色素 C 的含量，Bradford 法檢測(cè)蛋白的濃度。 2 . 4W e s t e r nb l o t t i n g 檢測(cè) C y tc 蛋白的表達(dá) 細(xì)胞造模 2 4 小時(shí)后進(jìn)

4、行胞漿蛋白的提取和定量，S D S 垂直電泳，獲得凝膠；含樣品的凝膠進(jìn)行電轉(zhuǎn)移后開(kāi)展免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)，免疫學(xué)：封閉 P V D F 膜 lh后，加入 C y tc 單克隆抗體，常規(guī)加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔 I g G ( 二抗) ， E C L 檢測(cè)試劑與膜作用暗室中曝光，X 線(xiàn)顯影、定影。凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。 2 . 5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 各組細(xì)胞造模 4 8h 后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞的

5、凋亡率。 2 . 6C a s p a s e - 3 ，C a s p a s e - 8 ，C a s p a s e - 9 酶活性的檢測(cè) 按試劑盒說(shuō)明完成。各組細(xì)胞造模 24 小時(shí)后，細(xì)胞密度為 2x106 cells/ml 。離心收集細(xì)胞后冰浴裂解。設(shè)置反應(yīng)體系，加入 Ac-DEVD - pNA(2mM)后 37℃孵育60- 120 分鐘。顏色變化比較明顯時(shí)即可測(cè)定 A405。蛋白濃度測(cè)定 Bradford 法檢測(cè)。Ca