葛根素抑制血清饑餓所致人成骨細胞凋亡及其相關機制研究.pdf

1、研究目的:本課題通過建立人成骨細胞體外培養(yǎng)實驗模型，從細胞及分子水平上觀察葛根素對人成骨細胞凋亡的影響，探討葛根素防治骨質疏松癥的作用機制，為葛根素應用于臨床防治骨質疏松癥提供實驗依據。
　　方法:①對購買的已鑒定的人成骨細胞進行復蘇、傳代、培養(yǎng)及凍存為下一步實驗做好準備;②以雌激素（10μM）干預為陽性對照，用ELISA觀察不同濃度(0，10-10M，10-9M,10-8M,10-7M,10-6M)葛根素對體外培養(yǎng)的hOBs凋亡

2、的影響;③TUNEL法檢測10-8M葛根素干預后對hOBs凋亡的影響;④Western blot檢測不同濃度(0，10-9M，10-8M，10-7M)葛根素對hOBs細胞內Bcl-2及Bax蛋白表達的影響;⑤觀察葛根素對hOBs細胞凋亡過程中的ERK信號通路的活化過程的影響;⑥體外應用ERK抑制劑PD98059干預離體培養(yǎng)細胞內的ERK信號轉導通路，ELISA進一步檢測葛根素對hOBs細胞凋亡的作用;⑦應用雌激素受體抑制劑ICI1827

3、80預處理hOBs細胞，ELISA檢測葛根素對hOBs細胞凋亡的影響。
　　結果:
　　1.葛根素能顯著抑制饑餓誘發(fā)的細胞凋亡。其中10-10M干預時ELISA吸收光密度為2.23±0.14，10-9M為1.89±0.16，10-8M為1.54±0.13,10-7M為1.62±0.15，10-6M為1.58±0.12，均顯著低于正常對照組2.51±0.11(allp＜0.05)，但較雌二醇干預的陽性對照組高(allp＜0.0

4、5)。不僅如此，10-9M葛根素對細胞凋亡的抑制作用顯著高于10-10M濃度組(p＜0.05)，而濃度達10-8M時，葛根素的細胞保護作用達最大值，明顯高于10-10M、10-9M及10-7M組(all p＜0.05)，但與10-6M濃度組差異并不顯著。10-8M葛根素干預后TUNEL陽性細胞數(shù)較饑餓對照組顯著下調(p＜0.05)。
　　2.與對照組相比，不同濃度葛根素均能顯著上調Bcl-2的蛋白表達(p＜0.05)，但明顯抑制細

5、胞內Bax的蛋白表達水平(p＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。不僅如此，10-8M葛根素干預后對Bcl-2及Bax表達的影響顯著高于10-9M組(p＜0.05），但較10-7M明顯降低(p＜0.05)。Bax/Bcl-2是評價細胞凋亡的另一重要指標，我們將對照組Bax/Bcl-2的比值定為1，10-9M葛根素干預組為0.39，10-8M干預組為0.19，10-7M干預組Bax/Bcl-2比例為0.08。
　　3.與對照組相比，葛根

6、素干預5min后體外培養(yǎng)的hOBs內ERK磷酸化水平顯著上調(p＜0.05)，至15min后，ERK磷酸化水平進一步升高，至45min時達頂峰，不同時間點組間差異顯著(allp＜0.05)。
　　4.葛根素+PD98059干預組細胞ELISA吸光度值（2.40±0.10）顯著高于單純葛根素干預組(1.54±0.13)(p＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學差異。而PD98059干預組細胞ELISA吸光度值(2.43±0.15)與對照組(2

7、.51±0.12)及葛根素+PD98059干預組并無顯著性差異。
　　5.ER抑制劑ICI182780預處理葛根素干預的hOBs細胞，結果證實葛根素+ICI182780干預組細胞ELISA吸光度值（2.52±0.15）顯著高于單純葛根素干預組（1.54±0.13）(p＜0.05），而ICI182780干預組細胞ELISA吸光度值(2.51±0.10)與對照組（2.51±0.12）及葛根素+ICI182780干預組無顯著性差異。