人IgA Fc受體FcαRI(CD89)的結(jié)構(gòu)和功能分析.pdf

1、FcαRI(CD89)是IgA的Fc受體,介導(dǎo)IgA和中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等髓性細(xì)胞之間發(fā)生的多種免疫效應(yīng)過(guò)程,其中包括:內(nèi)吞作用、抗原呈遞、ADCC、激活細(xì)胞產(chǎn)生超氧化物以及釋放細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)等.CD89是I型跨膜蛋白,膜外區(qū)包含兩個(gè)Ig樣折疊結(jié)構(gòu)域,胞內(nèi)區(qū)很短.染色體分布、序列同源性、配體結(jié)合和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)上的顯著差異使CD89區(qū)別于經(jīng)典的Fc受體.本工作擬通過(guò)解析CD89胞外區(qū)(sCD89)的晶體結(jié)構(gòu),從分子水平上解釋CD89

2、與配體IgA的相互作用,為此,多種原核或真核細(xì)胞中的表達(dá)體系被用于表達(dá)重組sCD89蛋白.在原核細(xì)胞中,非融合蛋白、GST融合蛋白、His·Tag融合蛋白和pelB引導(dǎo)的周質(zhì)表達(dá)等手段均無(wú)法實(shí)現(xiàn)sCD89的有效折疊,重組蛋白在菌體胞質(zhì)中形成沉淀;而在昆蟲(chóng)細(xì)胞中,我們利用包含sCD89編碼序列的重組桿狀病毒去感染正常Sf9細(xì)胞,成功地實(shí)現(xiàn)了sCD89在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá),Western blot檢測(cè)表明重組蛋白的糖基化程度很低.sCD89成熟

3、肽鏈中編碼Arg50和Arg51的兩個(gè)連續(xù)AGA密碼子對(duì)sCD89在原核細(xì)胞中的表達(dá)量有較大影響,將AGA同義突變成大腸桿菌常用的CGC和CGT后,sCD89的表達(dá)量和粗純化包涵體的純度都顯著提高.精氨酸鹽、尿素、鹽酸胍等變性劑被用于對(duì)sCD89包涵體的重折疊研究,sCD89在含有2.40-2.70M尿素溶液或1.8M鹽酸胍復(fù)性液中實(shí)現(xiàn)了有效的重折疊,復(fù)性蛋白質(zhì)能夠識(shí)別多種天然CD89分子的單克隆抗體以及配體IgA分子,提示復(fù)性蛋白已恢

4、復(fù)天然構(gòu)象.利用分段表達(dá)的sCD89肽段,我們將中和抗體MIP8a在CD89上的結(jié)合位點(diǎn)限定在Ala74至Ser91之間.點(diǎn)突變研究表明,Arg76、Tyr77和Gln78同時(shí)突變成Ala后,突變體喪失結(jié)合MIP8a的能力,但是任何一個(gè)單一位點(diǎn)的突變均不影響同MIP8a的結(jié)合;Arg82、His85突變?yōu)镚ly和Glu后,也不再結(jié)合MIP8a.sCD89的晶體結(jié)構(gòu)顯示,Arg76-Gln78和Arg82-His85在CD89分子表面上相