鴨卵黃囊膜IgY Fc受體基因的克隆與表達研究.pdf

1、鴨母源抗體能夠通過卵黃囊垂直傳播至剛孵化的雛鴨，發(fā)揮免疫應(yīng)答功能。其中IgY的含量最為豐富。我們推測鴨卵黃囊膜上存在能夠轉(zhuǎn)運IgY的受體。對哺乳動物FcRn和雞FcRy特性的研究，發(fā)現(xiàn)兩種受體結(jié)合抗體均具有pH依賴性，即在酸性條件下與抗體結(jié)合，中性或堿性條件下解離，籍此機制將母源抗體特異性轉(zhuǎn)運至新生動物體內(nèi)。而鴨IgY被轉(zhuǎn)運至雛鴨體內(nèi)的過程與此類似，但目前沒有關(guān)于鴨卵黃囊膜FcRy的相關(guān)報道，故對此展開研究。本研究的主要內(nèi)容如下:

2、>　　1.鴨FcRy的分離純化
　　采用辛酸-硫酸銨法和水溶稀釋法，從鴨蛋黃中粗提卵黃IgY，純化獲得了鴨完整型IgY，其重鏈約67KDa，輕鏈約25KDa。進一步制備鴨IgY-親和層析柱，通過調(diào)節(jié)不同pH值，從鴨卵黃囊膜分離純化獲得了鴨FcRy，其大小約為180KDa。
　　2.鴨FcRy全長基因的克隆與序列分析
　　從24-25日齡鴨胚中剝離卵黃囊膜，提取總RNA，經(jīng)過RT-PCR分5段擴增編碼鴨FcRy的基因片段

3、，將5個目的基因片段分別連接至pMD18-T載體后測序，拼接獲得了鴨FcRy全長基因，大小為6293bp，與已報道的鴨磷脂酶A2受體基因核苷酸同源性為99％。
　　3.鴨FcRy-CF的亞克隆、表達及純化
　　利用PCR方法亞克隆FcRyN-端富含半胱氨酸域-纖維連接蛋白Ⅱ型域(FcRy-CF)基因片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-KG-CF和pET-32a-CF，分別在大腸桿菌中進行了誘導表達。SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果顯示，

4、分別在約39KDa和33KDa處出現(xiàn)蛋白條帶，與預測的融合蛋白大小相符。并對這兩種蛋白進行純化，均得到較單一的目的蛋白。
　　4.兔抗鴨FcRy多克隆抗體的制備、純化與鑒定
　　利用純化的融合蛋白His-CF作為免疫原免疫家兔，成功制備了兔抗鴨FcRy高免血清，用間接ELISA法檢測其血清抗體效價高達1∶16000，并采用抗原親和層析法對所獲得的高免血清進行了純化。經(jīng)Western blot鑒定該多克隆抗體具有良好的特異性。

5、
　　5.應(yīng)用Western blot方法檢測鴨FcRy在各組織中的表達
　　利用制備的兔抗鴨FcRy高免血清，用Western blot方法檢測鴨FcRy在各組織中的表達情況。結(jié)果顯示，在鴨卵巢、輸卵管、氣管、肺、十二指腸、回腸、肝和腎組織中均有FcRy的表達。在空腸、直腸、心、脾、泄殖腔中未檢測到表達。
　　6.應(yīng)用免疫組織化學方法檢測鴨FcRy在體內(nèi)的表達與分布情況
　　利用純化的兔抗鴨FcRy多克隆抗體，