靶向調控IgA-FcαRI抗過敏性紫癜血管內皮細胞炎癥的分子機制研究.pdf

1、第一部分 FcαRI在兒童過敏性紫癜體內表達及其意義
　　目的：觀察急性期過敏性紫癜（HSP）患兒IgA Fc受體FcαRI在外周血及皮膚組織中的表達，了解血清可溶性sFcαRI-IgA和皮膚組織中FcαRI水平的相關性；同時探討FcαRI與炎癥相關因子的關系及其在兒童急性期HSP發(fā)病中的作用。
　　方法：采用Sandwich固相ELISA法、免疫組化及Westernblot等方法，分別檢測FcαRI在HSP患兒血清和皮損組

2、織中的表達和分布。直接免疫熒光檢測皮損組織中IgA、C3、Fib的沉積；ELISA檢測患兒血清FcαRI相關炎癥細胞因子IL-6、TNF-α的水平。
　　結果：
　　1、HSP皮膚組織FcαRI的免疫組化染色顯示，HSP各組皮膚組織均有明顯 FcαRI沉積，強陽性染色見于基底層、顆粒層，皮膚附屬器和汗腺導管，中性粒細胞也可見陽性表達，角質層未見 FcαRI表達。與對照組比較，HSP各組皮膚組織FcαRI組化染色強度明顯增加；

3、急性期HSP患兒皮損處FcαRI免疫組化HSCORE評分平均為205分，顯著高于正常對照組（p＜0.01）。western blot條帶灰度值分析HSP患兒組FcαRI蛋白表達較正常對照顯著增加，而HSP組與HSPN組之間無顯著性差異（p＞0.05）。
　　2、HSP組和HSPN組急性期血清可溶性sFcαRI-IgA水平較正常對照組明顯增高（p＜0.01），而HSP組和HSPN組之間無明顯統(tǒng)計學差異（p＞0.05）,血清sFcαR

4、I-IgA水平與皮膚組織FcαRI表達水平呈正相關(r=0.51, p=0.02)。急性期HSP血清IL-6水平較正常對照組增高（p＜0.01），HSP組和HSPN組之間無統(tǒng)計學意義（p＞0.05），急性期HSP患兒PBMC上清中TNF-ɑ水平高于正常對照組（p<0.05），HSPN組TNF-ɑ水平高于HSP組（p<0.05）。
　　結論：IgA受體FcαRI在HSP系統(tǒng)性血管炎癥中有重要作用，急性期HSP患兒血清sFcαRI-I

5、gA水平明顯增高，且與皮損中的表達呈正相關，F(xiàn)cαRI相關促炎細胞因子IL-6、TNF-α水平明顯增高，F(xiàn)cαRI直接參與了HSP免疫發(fā)病過程。
　　第二部分：HSP患兒中性粒細胞活化對血管內皮細胞的影響
　　目的：研究HSP患兒中性粒細胞活化對血管內皮細胞凋亡的影響及促炎細胞因子IL-8、TNF-ɑ在其中的作用，并探討FcαRI在不同類型配體IgA作用下對中性粒細胞活化致血管內皮細胞損傷的調控效應。
　　方法：采用流

6、式檢測HSP患兒外周血中性粒細胞早期活化標志分子CD11b；qPCR檢測外周血中性粒細胞FcαRI mRNA的表達，Westernblot檢測其蛋白的水平；細胞共培養(yǎng)技術構建HSP患兒中性粒細胞-血管內皮細胞炎癥模型，分別加入mIgA、pIgA干預，流式觀察mIgA、pIgA作用下HUVEC的凋亡；ELISA檢測細胞上清IL-8、TNF-α水平。
　　結果：
　　1、HSP組中性粒細胞FcαRI的mRNA表達與正常對照組比較

7、無統(tǒng)計學差異（P=0.98），F(xiàn)cαRI蛋白表達較正常對照顯著降低（p<0.05）， western blot條帶灰度值分析顯示HSP患兒較正常對照組降低，急性期HSP患兒中性粒細胞CD11b的平均熒光強度（MFI）顯著高于正常對照組（p＜0.01）。
　　2、HUVEC+HSP Neu+pIgA組血管內皮細胞平均凋亡率達63.99％，較 HUVEC+HSP Neu+mIgA組（27.07%）顯著增高（ p＜0.01）， HUVE

8、C+HSP Neu+pIgA組血管內皮細胞平均凋亡率高于HUVEC+HSP Neu+PBS組（34.9%）（p=0.01），HUVEC+HSP Neu+mIgA組凋亡率低于HUVEC+HSP Neu+PBS組，但無統(tǒng)計學差異（p＞0.05）。
　　3、HUVEC+HSP Neu+pIgA組細胞上清IL-8，TNF-α的水平顯著高于HUVEC+HSP Neu+mIgA組（p＜0.01，p＜0.01），較HUVEC+HSP Neu+P

9、BS組也增高（p<0.05，p<0.05）；HUVEC+HSP Neu+mIgA組細胞上清IL-8，TNF-α水平較HUVEC+HSP Neu+PBS組降低，但無統(tǒng)計學意義（p＞0.05，p＞0.05）。
　　結論：
　　1、急性期HSP中性粒細胞FcαRI在轉錄水平正常，但在蛋白水平較正常對照降低。中性粒細胞活化早期表達的粘附分子CD11b增高，可促進中性粒細胞向血管內皮細胞的粘附和遷移。
　　2、急性期HSP中性粒

10、細胞可誘導人臍靜脈內皮細胞HUVEC發(fā)生凋亡， pIgA對中性粒細胞介導的HUVEC凋亡具有促炎效應； mIgA對中性粒細胞介導的血管內皮細胞凋亡可能具有抑制效應。pIgA可促進血管內皮細胞炎性細胞因子 IL-8，TNF-α的分泌，mIgA對 IL-8， TNF-α的分泌可能具有抑制作用。
　　第三部分：IgA/FcαRI介導過敏性紫癜中性粒細胞-血管內皮細胞損傷的分子機制
　　目的：進一步研究IgA/FcαRI介導HSP中

11、性粒細胞活化損傷血管內皮細胞的分子機制，并探討FcαRI的單克隆抗體MIP8a阻斷后，不同類型配體IgA對中性粒細胞Syk、PI3K信號通路的調控作用。
　　方法：細胞共培養(yǎng)技術構建中性粒細胞-血管內皮細胞炎癥模型，不同種類配體IgA及FcαRI單克隆抗體MIP8a干預后，qPCR檢測中性粒細胞Syk、PI3K mRNA的表達，Westernblot檢測Syk、p-Syk、PI3K、p-PI3K蛋白的水平；流式檢測血管內皮細胞的凋

12、亡率。
　　結果：
　　1、pIgA各組中性粒細胞Syk、PI3K mRNA表達隨MIP8a濃度增大而降低，MIP8a0ug組顯著高于空白對照組（p＜0.01），MIP8a5ug組和10ug組均低于0ug組（p＜0.05，p＜0.05），而3ug組與0ug組無統(tǒng)計學差異（p＞0.05），mIgA各不同濃度組中性粒細胞中Syk、PI3K的mRNA表達隨MIP8a濃度增高而增高（p＜0.05）0ug與3ug之間無統(tǒng)計學差異（p＞

13、0.05）。
　　2、隨MIP8a濃度由0ug增加到10ug，pIgA各組非磷酸化Syk和PI3K蛋白的水平較空白對照組無統(tǒng)計學差異（p＞0.05），而磷酸化Syk（p-Syk）和磷酸化PI3K（p-PI3K）蛋白的水平則逐漸降低（p＜0.01）；在mIgA組，隨MIP8a濃度由0ug增加到10ug，p-Syk和p-PI3K蛋白的水平逐漸增高（p＜0.01）。
　　3、空白對照組模型HUVEC凋亡率為8.26%，pIgA組M

14、IP8a0ug凋亡率達到73.63%，加入MIP8a3ug，5ug，10ug后HUVEC凋亡率逐漸減少（p＜0.01）. mIgA組隨著MIP8a濃度由0ug增加到10ug，HUVEC凋亡率逐漸增加（p＜0.01）。
　　結論：胞內信號轉導分子Syk、PI3K是中性粒細胞FcαRI活化的重要信號通路，pIgA和mIgA通過信號通路Syk、PI3K與FcαRI交聯(lián)促進或抑制中性粒細胞活化，MIP8a能與IgA競爭性結合受體Fc段從而