酸敏感離子通道在過敏性紫癜患兒血管內(nèi)皮損傷中的調控作用.pdf

1、目的：
　　本研究通過觀察過敏性紫癜（HSP）患兒血清aIgA1和胞外酸刺激對體外培養(yǎng)的人皮膚微血管內(nèi)皮細胞（HDMECs）中酸敏感離子通道（ASICs）表達的影響，及其對炎癥因子分泌和細胞骨架蛋白表達的影響，并且觀察酸敏感離子通道阻斷劑對內(nèi)皮細胞損傷的保護作用，探討ASICs在HSP患兒血管內(nèi)皮細胞炎性損傷中的調控作用。
　　方法：
　　1.樣本采集及聚合IgA1（aIgA1）的分離及純化選取本院2015年1月至20

2、15年6月初發(fā)急性期HSP患兒10例，另外選取10名健康體檢兒童作為正常對照組。抽取所有受試者清晨空腹狀態(tài)下5ml外周靜脈血，離心分離血清，用Jacalin親和層析法及蛋白純化法提取血清aIgA1。
　　2.實驗分組將分化成熟的HDMECs消化后培養(yǎng)于六孔板中。預實驗中,將六孔板細胞分為四組：1組為pH6.0組；2組為pH6.5組；3組為pH7.0組；4組為pH7.4組，每組三孔，將Hepes液依次加入1、2、3、4組，調整培養(yǎng)液

3、pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.4，培養(yǎng)4h。另外將六孔板細胞分為十組：1組為空白對照組；2組為pH6.5組；3組為正常IgAl組；4組為正常IgAl+pH6.5組；5組為正常IgAl+pH6.5+阿米洛利組；6組為正常IgAl+pH6.5+PcTX1組；7組為HSP IgAl組；8組為HSP IgAl+pH6.5組；9組為HSP IgAl+pH6.5+阿米洛利組；10組為HSP IgAl+pH6.5+PcTX1組，每組3個孔；

4、將健康兒童或HSP患者血清的aIgA1加入六孔板中，3-6組加健康兒童aIgAl，7-10加HSP患者aIgA1，并調整培養(yǎng)基中aIgA1最終濃度250μg/ml，培養(yǎng)6h后棄去上清液；5組、9組加入阿米洛利100μmol/L，6組、10組加入PcTX120nmol/L，0.5h后，將Hepes液依次加入2、4、5、6、8、9、10組，調整培養(yǎng)基pH值為6.5，培養(yǎng)4h。
　　3.IL-8、NO和TM的濃度測定采用酶聯(lián)免疫吸附法（

5、ELISA）分別檢測細胞上清液中IL-8、NO和TM水平。
　　4.分析ASICs、 destrin和 SM-αmRNA和蛋白的表達分別采用實時定量聚合酶鏈反應(qPCR)和蛋白免疫印跡法（WB）分析實驗組ASIC1a、ASIC2a、ASIC3、destrin and和 SM-αmRNA和蛋白的表達情況和預實驗組ASIC1a、ASIC2a、ASIC3 mRNA表達情況。
　　結果：
　　1、預實驗中，pH6.5組HDM

6、ECs中的ASIC1a、ASIC2a、ASIC3 mRNA表達量較其他三組明顯增多，差異均有統(tǒng)計學意義（P均<0.05）；
　　2、細胞外酸化和HSP患兒血清aIgA1能誘導HDMECs中酸敏感離子通道(ASIC1a、ASIC2a、ASIC3)表達上調, pH6.5組和HSP IgAl組較空白對照組及正常IgAl組ASICs表達量多，且HSP IgAl+pH6.5組較HSP IgAl組ASICs表達量多，差異均有統(tǒng)計學意義（P均<

7、0.05）；
　　3、細胞外酸化和HSP患兒血清aIgA1能刺激HDMECs中IL-8、TM及NO釋放，pH6.5組和HSP IgAl組均較空白對照組及正常IgAl組IL-8、TM及NO釋放量明顯增多，且HSP IgAl+pH6.5組較HSP IgAl組IL-8、TM及NO釋放量明顯增多，阿米洛利和PcTX1能夠抑制炎癥因子的過多釋放，HSP IgAl+pH6.5+阿米洛利組和HSP IgAl+pH6.5+PcTX1組較HSP I

8、gAl+pH6.5組IL-8、TM及NO釋放量減少。此外，在HSP IgAl+ pH6.5組中，IL-8、TM、NO水平分別與ASIC1a mRNA表達水平呈正相關關系(R=0.947,0.864,0.829);IL-8、TM、NO水平分別與ASIC2a mRNA表達水平呈正相關關系（R=0.833,0.827,0.874）；IL-8、TM、NO水平分別與ASIC3 mRNA表達水平呈正相關關系（R=0.777,0.851,0.693）

9、,差異均有統(tǒng)計學意義（P均<0.05）；
　　4、細胞外酸化和HSP患兒血清aIgA1能減少HDMECs中細胞骨架蛋白(destrin、SM-α)的表達，pH6.5組和HSP IgAl組均較空白對照組及正常IgAl組destrin、SM-α表達量明顯減少，且HSP IgAl+pH6.5組較HSP IgAl組destrin、SM-α表達量明顯減少，阿米洛利和PcTX1能夠抑制destrin、SM-α的表達減少，HSP IgAl+pH

10、6.5+阿米洛利組和HSP IgAl+pH6.5+PcTX1組較HSP IgAl+pH6.5組destrin、SM-α表達量多，此外，在HSP IgAl+pH6.5組中，destrin和SM-αmRNA的表達水平與ASIC1a mRNA表達水平呈負相關關系(R=-0.713,-0.867), destrin和SM-αmRNA的表達水平與ASIC2a mRNA表達水平呈負相關關系(R=-0.842,-0.798)，destrin和SM-α

11、mRNA的表達水平與ASIC3 mRNA表達水平呈負相關關系(R=-0.671,-0.742)，差異均有統(tǒng)計學意義（P均<0.05）；
　　結論：
　　細胞外酸化和HSP患兒血清aIgA1均能誘導體外培養(yǎng)的HDMECs中酸敏感離子通道(ASICs)的表達上調,引起炎癥因子的大量釋放及細胞骨架蛋白下調，造成內(nèi)皮細胞受損；其中，胞外酸化作用更強。而ASICs阻斷劑能抑制這些效應，對血管內(nèi)皮細胞損傷有顯著的保護作用，從反面也證明了