聚乙烯亞胺-DNA疫苗遞釋系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和呼吸道免疫效果評(píng)價(jià).pdf

1、本論文研究?jī)?nèi)容包括兩個(gè)部分，第一部分為聚乙烯亞胺-DNA疫苗遞釋系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和呼吸道免疫效果評(píng)價(jià)；第二部分為苯甲酸利扎曲普坦鼻腔噴霧劑的研制及腦內(nèi)遞藥特性研究。 第一部分聚乙烯亞胺-DNA疫苗遞釋系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和呼吸道免疫效果評(píng)價(jià) 21世紀(jì)的今天，人類依然面臨著傳染病的巨大威脅。呼吸道免疫能同時(shí)誘導(dǎo)系統(tǒng)和粘膜免疫應(yīng)答，對(duì)有效控制和消滅傳染病特別是呼吸系統(tǒng)感染具有十分重要的意義。DNA疫苗具有誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫的能力，而且制

2、備簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性好，因此DNA疫苗經(jīng)呼吸道免疫可望為呼吸道傳染病的防治帶來(lái)希望。但目前該方面的研究還處于初期階段，其癥結(jié)所在是缺乏高效低毒的DNA疫苗遞釋系統(tǒng)。病毒載體雖然高效，但其安全性存在極大隱患，而且載體的構(gòu)建成本非常昂貴，目的基因容量小、靶向特異性差。所以研究開發(fā)高效、安全的非病毒載體是當(dāng)今基因治療的重要發(fā)展方向。但是，非病毒載體最大的缺陷是轉(zhuǎn)染效率低，不能產(chǎn)生有意義的蛋白表達(dá)。本研究針對(duì)DNA進(jìn)入細(xì)胞表達(dá)蛋白(抗原)的主要障礙，

3、即胞外屏障和胞內(nèi)屏障，設(shè)計(jì)了三種新型的基于聚乙烯亞胺(PEI)的DNA疫苗非病毒載體，并以結(jié)核分支桿菌抗原Ag85B基因?yàn)槟康幕颍u(píng)價(jià)了三種基因遞釋系統(tǒng)經(jīng)鼻腔給藥后的免疫效果。 第一章將結(jié)核分支桿菌抗原Ag85B基因克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.O中，構(gòu)建成重組pcDNA85b，為了提高該疫苗的免疫原性，在該質(zhì)粒中插入組織纖維蛋白溶酶原激活因子(tPA)信號(hào)序列，由此構(gòu)建成能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中獲得高效表達(dá)的結(jié)核桿菌DNA疫苗—

4、pcDNA85btPA，并且通過(guò)酶解和測(cè)序鑒定了其構(gòu)建的準(zhǔn)確性。 第二章針對(duì)PEI／DNA復(fù)合物溶解性差的問(wèn)題，將PEI進(jìn)行不同程度的聚乙二醇(PEG)修飾(每個(gè)PEl分子接枝1、2、5、10和20個(gè)PEG)，以期增加復(fù)合物溶解度，減少相互聚集以及與體液中蛋白的相互作用。為了考察PEG化對(duì)PEI／DNA性質(zhì)的影響，通過(guò)凝膠電泳阻滯分析和包封率測(cè)定，評(píng)價(jià)了PEG化的PEI與DNA的結(jié)合情況，采用MTr法評(píng)價(jià)復(fù)合物的細(xì)胞毒性。結(jié)果表

5、明：PEI在PEG化后其與DNA的結(jié)合有不同程度的降低，但其復(fù)合物的毒性降低。體內(nèi)外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證明，PEI在PEG化后的轉(zhuǎn)染效率隨著PEG接枝率的增加而降低，但在比較低接枝率(即每個(gè)PEl分子接枝1個(gè)或2個(gè)PEG)的情況下，調(diào)整N／P值，仍能得到較為理想的體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率。體外轉(zhuǎn)染結(jié)果表明PEI-PEG-1／DNA復(fù)合物在N／P為9時(shí)，PEI-PEG-2／DNA復(fù)合物在N／P為12時(shí)的轉(zhuǎn)染效果與PEI／DNA復(fù)合物最佳轉(zhuǎn)染效果相似，但在體內(nèi)

6、應(yīng)用時(shí)前兩者體現(xiàn)了一定優(yōu)勢(shì)，其轉(zhuǎn)染效率分別是PEI／DNA復(fù)合物N／P為9時(shí)的2.35倍和2.29倍，存在極顯著性差異(P<0.01)，這是因?yàn)镻EG的隱形作用使其在體內(nèi)應(yīng)用顯示優(yōu)勢(shì)。 第三章利用呼吸道細(xì)胞膜上存在凝集素，能特異地與糖基結(jié)合的特性，采用具有雙功能基團(tuán)的N-hydroxysuccinimide—PEG-Maleimide(NHS-PEG-MAU)，NHS一端專屬性地與氨基半乳糖上的氨基結(jié)合，MAL一端專屬性地與PE

7、l分子多胺中的氨基結(jié)合。凝膠阻滯和包封率測(cè)定等實(shí)驗(yàn)證明PEl分子在修飾0.5％，l％，5％mol／mol糖基后，其與DNA的結(jié)合作用降低，但調(diào)整N／P值后其與DNA的結(jié)合仍較牢固；另外在PEl分子中引入了糖基和PEG的親水鏈后，其細(xì)胞毒性大大降低。將Gala-PEG-PEI／DNA復(fù)合物分別轉(zhuǎn)染16HBEl40細(xì)胞(細(xì)胞膜上有凝集素表達(dá))和NIH3T3細(xì)胞(細(xì)胞膜上無(wú)凝集素表達(dá))，體外轉(zhuǎn)染結(jié)果證明1％Gala-PEG-PEI／DNA在N

8、／P為36時(shí)的轉(zhuǎn)染效率是PEI／DNA在N／P為6時(shí)的3.1倍，而在沒(méi)有凝集素的NIH3T3細(xì)胞上，該復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率卻僅為PEI／DNA的0.06倍?？梢?jiàn)，Gala-PEG-PEI／DNA復(fù)合物確實(shí)通過(guò)受體介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，增加了轉(zhuǎn)染效果。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也充分顯示了PEG化的優(yōu)勢(shì)，1％的Gala-PEG-PEI／DNA在N／P為24，36和48時(shí)的轉(zhuǎn)染效率分別為PEFDNA在N／P為9時(shí)的3.0、11.6和6.7倍。 第四章針對(duì)DNA載

9、體系統(tǒng)不能有效進(jìn)入細(xì)胞膜或進(jìn)入膜后易在溶酶體環(huán)境下降解失活及不能有效進(jìn)入細(xì)胞核的問(wèn)題，以人體免疫缺陷病毒(HIV)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域Tat蛋白修飾PEI，該蛋白具有直接穿過(guò)細(xì)胞膜或者促進(jìn)溶酶體破壞功能，此外Tat蛋白具有一段核定位序列(NuclearLocalizationSequence，NLS)，可以增加外源基因轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核，提高轉(zhuǎn)染效果。本研究首先將Tat蛋白PEG化，即將Tat蛋白中的巰基與mPEG-MAL反應(yīng)，使MAL一端專屬性地與

10、Tat蛋白中的巰基結(jié)合，該載體引入PEG的長(zhǎng)鏈后能防止Tat蛋白與DNA形成復(fù)合物時(shí)相互聚集；然后將PEG化的Tat蛋白與DNA在一定質(zhì)量比的條件下反應(yīng)，通過(guò)正負(fù)電荷的相互吸引形成復(fù)合物，再將該復(fù)合物與帶陽(yáng)離子的PEG化的PEI結(jié)合，形成三元復(fù)合物。包封率測(cè)定證明PEI在修飾Tat蛋白后其與DNA的結(jié)合作用沒(méi)有降低。體內(nèi)外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明，Tat蛋白修飾PEI后能夠增加轉(zhuǎn)染效率，PEI-PEG-1／PEG-Tat-1／DNA在N／P為9時(shí)的

11、轉(zhuǎn)染效率為PEI-PEG--1／DNA在N／P為9時(shí)的2.81倍；其體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率為后者的2.01倍，存在顯著性差異(P<0.05)。但蛋白的修飾方法和修飾量應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化，以期獲得更高的表達(dá)。 第五章對(duì)上述三種修飾的PEI/pcDNA85btPA復(fù)合物的免疫效果進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。采用鼻腔給藥途徑免疫BALB/c小鼠，研究了四種基于PEI(其中一種為未修飾的PEI，其它三種分別為采用上述三種方法修飾的PEI在動(dòng)物體內(nèi)得到最高表達(dá)的載體)

12、的非病毒載體遞送pcDNA85btPA疫苗誘導(dǎo)的體液免疫(包括粘膜免疫)和細(xì)胞免疫情況，初步評(píng)價(jià)疫苗的免疫效果。結(jié)果顯示三種基因載體復(fù)合物均誘導(dǎo)較強(qiáng)的系統(tǒng)IgG、局部粘膜IgA，特異性淋巴細(xì)胞增殖和較強(qiáng)的IFN-γ水平，表明三種復(fù)合物均具有載DNA疫苗進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)目的蛋白，同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫(包括系統(tǒng)和局部)和細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。Gala-PEG-PEI/pcDNA85btPA復(fù)合物、PEI-PEG-1／PEG-Tat／DNA復(fù)合物誘

13、導(dǎo)的免疫應(yīng)答水平均顯著高于PEI/pcDNA85btPA復(fù)合物和PEI-PEG-1pcDNA85btPA復(fù)合物，特別是PEI-PEG-1／PEG-Tat／DNA復(fù)合物誘導(dǎo)的粘膜免疫水平顯著高于其他組，將有望在呼吸道感染性疾病的防治中起到一定作用。 第六章對(duì)幾種修飾的PEI／DNA復(fù)合物經(jīng)鼻腔給藥后對(duì)小鼠肺部損傷性進(jìn)行了初步考察。組織學(xué)觀察表明，PEDNA組鼻腔給藥后肺部出現(xiàn)了中等程度的炎癥，而修飾的PEI／DNA組則只產(chǎn)生輕度的

14、炎癥，說(shuō)明對(duì)PEI進(jìn)行修飾能顯著降低復(fù)合物對(duì)肺的損傷，具有良好的生理適應(yīng)性。 第二部分苯甲酸利扎曲普坦鼻腔噴霧劑的研制及腦內(nèi)遞藥特性研究 苯甲酸利扎曲普坦(Rizatriptanbenzoate，以下將利扎曲普坦簡(jiǎn)稱為RIZA)為新一代5-HTlB／ID受體激動(dòng)劑，用于成人有先兆或無(wú)先兆偏頭痛的急性治療。RIZA目前臨床應(yīng)用的給藥途徑為口服給藥，但常規(guī)的片劑并非偏頭痛治療的最佳制劑，因?yàn)橥谭瑒┗蚝人畷?huì)加重偏頭

15、痛導(dǎo)致的惡心和嘔吐；再次偏頭痛所導(dǎo)致的胃腸道副反應(yīng)(嘔吐，胃腸道動(dòng)力低下，胃排空延緩等)往往會(huì)影響藥物的吸收，延緩藥效。因此，研制一種有效、便捷的新劑型和給藥方法具有較高的臨床意義。 鼻腔給藥是近年來(lái)研究較多的給藥途徑之一，不僅具有藥物吸收迅速、無(wú)首過(guò)效應(yīng)、給藥方便、患者順應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，而且還具有向腦內(nèi)遞藥的特性。上述特點(diǎn)均有利于中樞啟動(dòng)型藥物RIZA以鼻腔給藥方式應(yīng)用于臨床偏頭痛的治療。本課題擬將RIZA制成鼻腔噴霧劑，評(píng)價(jià)其