蛭弧菌菌株篩選、保存條件優(yōu)化與其在水產(chǎn)養(yǎng)殖臨床應(yīng)用效果研究.pdf

1、噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)(以下簡稱蛭弧菌)是一類通過裂解其他細(xì)菌進(jìn)行生長繁殖的寄生性細(xì)菌，是自然環(huán)境中病原菌滋生的天然生物控制因子，譽有“活性抗生素”的美稱，目前已在廣大的水產(chǎn)養(yǎng)殖中作為一種凈化水質(zhì)、控制水體病原菌數(shù)量的新型微生態(tài)制劑廣泛的使用著。為了更好的將蛭弧菌作為一株可在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治上廣泛應(yīng)用的菌株，本文提出了BDF—HlO、BDF—H16、BDF-H23三株蛭弧菌優(yōu)化篩選菌株，提供了

2、菌株高效、簡單保藏方法，并對其生物學(xué)特性及在水產(chǎn)動物病害防治和水質(zhì)凈化的效果進(jìn)行了研究： 1.蛭弧菌優(yōu)秀菌株BDF—H10、BDF—H16、BDF—H23的篩選及其部分生物學(xué)特性的研究：本實驗采用實驗室常用菌株大腸桿菌為篩選宿主菌，對實驗室保存的不同來源的蛭弧菌株進(jìn)行復(fù)蘇和篩選，并對其形態(tài)、噬菌范圍、最適生長條件(宿主菌濃度、pH、溫度)以及耐鹽性等生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，以期篩選目的優(yōu)秀菌株，合理應(yīng)用到水產(chǎn)病害防治時提供理論依據(jù)

3、。實驗結(jié)果表明：蛭弧菌BDF—H10、BDF—H16、BDF—H23在實驗室的復(fù)蘇過程中活力都比較高，其噬菌斑均值為7.0、1.2、0.9 mm；其噬斑數(shù)量均值為168、1021、1880 PFU/100 μl。其生物學(xué)特性為BDF—H10最適生長條件為pH7.5～8.0、溫度35℃，在10％NaC1含量的培養(yǎng)基中可生長；BDF—H16的最適生長條件為pH7.0～7.5、溫度35℃，在10％NaCl以上的培養(yǎng)基中不可生長；BDF-H23

4、的最適生長條件為pH7.5～8.0、溫度35℃，在10％NaCl以上的培養(yǎng)基中不可生長。其中只有BDF—H23對枯草芽孢桿菌可裂解。實驗發(fā)現(xiàn)大腸桿菌懸液濃度小于104cfu/mL時，三株蛭弧菌都可生長；BDF—H16在試驗室長期保存狀態(tài)下其生物學(xué)特性有所改變，但噬菌譜沒有縮小。 2.蛭弧菌優(yōu)秀菌株BDF—H16長期簡易保藏方法研究：試驗中主要考慮了不同的保護液、保藏溫度和保藏載體的選擇對蛭弧菌BDF—H16長期保藏的影響，以及對

5、優(yōu)化保藏條件下的蛭弧菌BDF—H16復(fù)蘇率和復(fù)蘇蛭弧菌的噬菌能力檢測，并且對保藏期限內(nèi)宿主菌的存活情況與蛭弧菌的存活情況的相互影響做了首次的報道。結(jié)果表明：以1/100NB等低營養(yǎng)液體為保護液、瓊脂為載體、加入適量宿主菌于4℃保存可達(dá)兩年以上，保存期內(nèi)蛭弧菌的復(fù)蘇率和出斑數(shù)目相有極其顯著的提高(P<0.01)。宿主菌的數(shù)量在保藏期內(nèi)呈下降趨勢，但當(dāng)下降到1.0×104cfu/mL時就進(jìn)入穩(wěn)定期，數(shù)目就不在有數(shù)量級的變化了。在宿主菌的濃度

6、下降到1.0×106cfu/mL之前，蛭弧菌的數(shù)目保持在1.0×103pfu/mL；在宿主菌的濃度下降到1.0×105cfu/mL之后，蛭弧菌的數(shù)下降至1.0×102pfu/mL。最后，二元保藏中宿主菌/蛭弧菌濃度比保持為104/102。BDF—H16復(fù)蘇后最適生長條件有所改變，噬菌能力有明顯的增強，但噬菌譜沒有改變。 3.恩諾沙星對蛭弧菌BDF—H16生長及吸附影響的研究：本實驗通過觀察不同濃度恩諾沙星對固體培養(yǎng)條件下蛭弧菌

7、產(chǎn)生噬斑和液體培養(yǎng)條件下蛭弧菌增殖的情況，以及蛭弧菌在不同濃度恩諾沙星下吸附到載體上的情況，研究了恩諾沙星對蛭弧菌BDF—H16生長及吸附的影響。實驗發(fā)現(xiàn)：2，5，10，20，50μg/mL恩諾沙星對蛭弧菌BDF—H16噬斑的產(chǎn)生及增殖均具有抑制作用(P<0.05)。在固體培養(yǎng)72 h后，隨著恩諾沙星濃度逐漸增大，蛭弧菌BDF—H16產(chǎn)生的噬斑數(shù)目逐漸減少；在液體培養(yǎng)72 h后，隨著恩諾沙星的濃度逐漸增高，蛭弧菌BDF—H16的增殖濃度

8、不斷減少，但10μg/mL恩諾沙星并沒有改變蛭弧菌BDF—H16的生長趨勢。此外，以沸石作為吸附載體，2，5，10，20，50μg/mL恩諾沙星降低了蛭弧菌BDF—H16吸附量，隨著恩諾沙星濃度的增大，蛭弧菌BDF—H16的吸附量逐漸降低，而蛭弧菌BDF—H16的吸附率卻在一定恩諾沙星濃度(2～20μg/mL)下卻有所升高(P<0.05)。結(jié)果表明，恩諾沙星對蛭弧菌BDF—H16噬斑的產(chǎn)生及增殖具有抑制作用，但在有載體存在的情況下，蛭弧

9、菌的吸附能力在一定恩諾沙星濃度范圍內(nèi)有所增強，添加載體沸石有助于降低恩諾沙星對蛭弧菌BDF—H16的不良影響。 4.蛭弧菌對鱘魚免疫相關(guān)酶活性的影響：本實驗對鱘魚基礎(chǔ)飼料噴灑蛭弧菌制劑，以1.0×109pfu/mL的蛭弧菌BDF—H16制劑，加入量分別為0 ml/10g(對照)， 3ml/10g，6 m1/10g，9 ml/10g，于30 d后分別測定血清中免疫相關(guān)酶的活性。結(jié)果表明，血清中溶菌酶活性變化特點是：相對于對照組，實

10、驗組的溶菌酶活性都極顯著的增強(P<0.01)；血清中AKP活性變化特點是：相對于對照組，實驗組的AKP活性都顯著的增強(P<0.05)；血清中POD活性變化特點是：相對于對照組，實驗組的POD活性都顯著的增強(P<0.05)；綜合本次研究結(jié)果表明，飼料中添加蛭弧菌能對鱘魚體內(nèi)免疫相關(guān)酶系統(tǒng)產(chǎn)生積極地調(diào)理改善作用，使其非特異性免疫力得到改善與提高．結(jié)合養(yǎng)殖成本與文章結(jié)果得出的最低有效濃度，建議其適宜添加量為5～8 ml/10g。

11、 5.蛭弧菌BDF—H16對鱘魚養(yǎng)殖池水質(zhì)的影響：以500mL/畝的用量向鱘魚養(yǎng)殖池潑灑濃度為1.0×109pfu/mL的蛭弧菌BDF—H16制劑，觀察了7天內(nèi)養(yǎng)殖池的pH、DO含量、弧菌總數(shù)等主要水質(zhì)指標(biāo)及鱘魚死亡率的變化。實驗結(jié)果表明，向鱘魚養(yǎng)殖池加入蛭弧菌BDF—H16后，與對照組相比，試驗組弧菌總數(shù)明顯減少(p<0.05)，DO明顯增大(p<0.05)，但pH變化不明顯(p>0.05)；此外，鱘魚死亡數(shù)量也明顯減少(p<0.05