幽門螺桿菌抗原rUreB、rOmp11經(jīng)3種黏膜途徑接種BALB-c小鼠的免疫效果研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一能在胃內(nèi)定植的細菌，Hp感染呈全球分布，多數(shù)地區(qū)感染率在50％左右。Hp感染是慢性活動性胃炎的直接原因，與胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃癌及胃黏膜相關(guān)性淋巴樣組織(mucosa-associatedlymphoidtissue，MALT)淋巴瘤密切相關(guān)。在1994年，WHO就己將幽門螺桿菌確定為Ⅰ類致癌原。目前，臨床主要采用質(zhì)子泵抑制劑聯(lián)合多種抗生素治療Hp感染，但由

2、于存在價格昂貴，容易復發(fā)及不能阻止再感染Hp等問題，在應用上受到一定限制。在全球Hp感染率居高不下的形勢下，采用免疫接種的方法控制Hp感染，不失為一種簡便、經(jīng)濟、高效的途徑。 目前，Hp疫苗的保護性免疫機制尚未明晰，對特異性抗體反應的重要性的了解也不夠深入，雖然黏膜抗體反應不是抵御感染的唯一因素，但是黏膜局部的免疫反應最有可能產(chǎn)生保護作用，能夠在局部胃黏膜產(chǎn)生的分泌性IgA是保護性免疫的關(guān)鍵。而且，黏膜免疫能夠避免由于使用污染或

3、消毒不嚴格的針頭而傳播疾病的危險。 由于Hp是一種非入侵性細菌，定植于胃黏膜層，最初人們認為經(jīng)口免疫應該是最佳的免疫途徑并能夠有效地根除Hp感染，然而，胃內(nèi)的酸性環(huán)境能夠便抗原蛋白迅速降解，疫苗的有效成分大大喪失，尋找一種能夠在胃內(nèi)酸性環(huán)境下保持穩(wěn)定的疫苗是非常困難的。其他的黏膜免疫途徑如經(jīng)鼻腔免疫、經(jīng)直腸免疫也是有效的免疫途徑。許多學者致力于研究Hp疫苗經(jīng)不同黏膜途徑的免疫效果，可能由于應用不同的抗原及佐劑組合，所得到的結(jié)果各

4、不相同，到目前為止，Hp疫苗最有效的黏膜投遞方法仍難以確定。 為加強局部黏膜免疫，激活黏膜免疫應答，使疫苗發(fā)揮最大作用，可通過在疫苗中加入適當?shù)拿庖咦魟┻M行免疫接種。大腸桿菌不耐熱腸毒素(heat-labileenterotoxin，LT)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的作用最強的免疫原之一，并且具有很好的黏膜免疫佐劑作用，但LT的高毒性限制了它的應用。在LT衍生物中，第63位氨基酸無毒突變體沒有毒性，并且具有良好得免疫佐劑活性，很有可能作為能

5、夠應用于人體的Hp疫苗的黏膜佐劑。 本研究對本室己構(gòu)建的幽門螺桿菌亞單位疫苗rUreB、rOmp11及LT第63位氨基酸突變體mLT63的原核表達系統(tǒng)進行表達、純化、鑒定，將獲得的純化抗原rUreB、rOmp11聯(lián)合黏膜免疫佐劑mLT63應用于免疫途徑的研究。通過3種不同的黏膜免疫途徑：經(jīng)口、經(jīng)鼻和經(jīng)直腸免疫接種BALB/c小鼠，評價不同免疫途徑所產(chǎn)生的免疫應答和免疫保護效果，以確定最佳免疫途徑，為Hp疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

6、 實驗方法1.基因工程重組菌TB1(pMAL-c2X-omp11)、TB1(pMAL-c2X-ureB)的誘導表達以及融合蛋白rOmp11和rUreB的鑒定及純化采取pH值7.2、IPTG終濃度為0.3mmol/L、葡萄糖濃度為0.10％的LB培養(yǎng)基，在37℃進行誘導表達。表達產(chǎn)物處理后經(jīng)SDS-PAGE電泳，分析融合蛋白rUreB、rOmp11的表達水平，Westernblot鑒定融合蛋白的免疫反應性，誘導表達產(chǎn)物經(jīng)超聲粉碎，超聲上

7、清經(jīng)初步鹽析后，應用直鏈淀粉親和層析柱進行純化。 2.基因工程重組菌TB1(pMAL-c2X-mlt)的誘導表達以及融合蛋白mLT63的純化、鑒定及毒性測試。采取不同的pH值、IPTG濃度、葡萄糖濃度、及不同的溫度(37℃、25℃)、不同的培養(yǎng)基(TB培養(yǎng)基、SOC培養(yǎng)基)等條件，進行誘導表達，表達產(chǎn)物處理后經(jīng)SDS-PAGE電泳，分析融合蛋白mLT63在不同條件下的表達水平。選取最佳條件對重組菌進行大量誘導，誘導表達產(chǎn)物經(jīng)超聲

8、粉碎，超聲上清經(jīng)初步鹽析后，應用經(jīng)直鏈淀粉親和層析柱進行純化，Westernblot鑒定融合蛋白的免疫反應性，家兔回腸袢試驗檢測mLT63的毒性。 3.3種黏膜途徑及不同抗原和佐劑組合誘導的免疫效果研究BALB/c小鼠隨機分為7組，即rUreB、rOmp11聯(lián)合免疫佐劑經(jīng)口免疫組、rUreB、rOmp11聯(lián)合免疫佐劑經(jīng)鼻腔免疫組、rUreB、rOmp11聯(lián)合免疫佐劑經(jīng)直腸免疫組、rUreB聯(lián)合免疫佐劑經(jīng)口免疫組、rOmp11聯(lián)合

9、免疫佐劑經(jīng)口免疫組、rUreB、rOmp11經(jīng)口免疫組及空白對照組。分別在第1、21天各免疫1次，末次免疫2周后，各組均處死10只小鼠，取血清、胃液、糞便提取物，檢測其中的特異性抗體水平，以此評價不同免疫途徑及不同抗原和佐劑組合的免疫應答效果。余下各組小鼠均用Hp(NCTC11637)攻擊，共攻擊感染2次，間隔2天。末次攻擊2周后處死小鼠，取小鼠胃組織分別作尿素酶定性試驗和半定量試驗、Hp培養(yǎng)、涂片Gram's染色鏡檢、及組織學檢查，檢

10、測免疫接種對Hp在小鼠胃內(nèi)定植的影響，以此評價不同免疫途徑及不同抗原和佐劑組合的免疫保護效果。 4.統(tǒng)計學分析資料錄入后，應用SAS9.13統(tǒng)計分析軟件包進行分析。各組數(shù)值變量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗后，各組間比較采用單因素方差分析，均數(shù)間的兩兩比較采用LSD-t檢驗，各組之間保護率的比較采用四格表確切概率法進行分析，以α=0.05為檢驗水準。 結(jié)果1.基因工程重組菌TB1(pMAL-c2X-omp11)、TB1(pMAL-c2

11、X-ureB)的表達、純化結(jié)果TB1(pMAL-c2X-omp11)、TB1(pMAL-c2X-ureB)在37℃，pH值7.2、葡萄糖濃度為0.10％的LB培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)中，以0.3mmol/LIPTG誘導4h表達量最高。分別占全菌蛋白的23.95％、20.43％，表達產(chǎn)物經(jīng)Westernblot分析，結(jié)果顯示融合蛋白能夠被Hp感染陽性病人的血清所識別，證實所得到的融合蛋白具有良好的免疫反應性。粗提蛋白經(jīng)直鏈淀

12、粉親和層析柱純化后，融合蛋白的純度分別達到了93.28％、90.73％。 2.基因工程重組菌TB1(pMAL-c2X-mlt)在不同條件下的誘導表達以及融合蛋白mLT63的純化及毒性檢測結(jié)果TB1(pMAL-c2X-mlt)在37℃，pH值為7.8，不含葡萄糖的LB培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)中，以0.2mmol/LIPTG誘導6h表達量最高，約占全菌蛋白的16.11％。誘導表達產(chǎn)物超聲后上清及沉淀進行SDS-PAGE

13、電泳，經(jīng)Genetools軟件分析，融合蛋白mLT63以可溶性蛋白形式存在。純化后重組蛋白的純度達到了72.58％。純化產(chǎn)物進行Westernblot分析，結(jié)果顯示融合蛋白能夠被兔抗CT血清所識別，證實純化后的融合蛋白具有良好的免疫反應性。家兔回腸袢試驗檢測融合蛋白mLT63的毒性，注入50μgmLT63的腸段內(nèi)液體積聚量為0.03ml/cm；而注入0.1μgLT的腸段內(nèi)液體積聚量為1.2ml/cm，證實我們所構(gòu)建表達的LT第63位氨基

14、酸無毒突變體沒有毒性。 3.Hp抗原rUreB、rOmp11聯(lián)合黏膜免疫佐劑mLT63經(jīng)不同黏膜途徑免疫BALB/c小鼠的免疫應答及免疫保護效果不同黏膜途徑所引起的黏膜局部及系統(tǒng)免疫應答結(jié)果之間的差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。血清中特異性IgG結(jié)果顯示：三種免疫途徑之間的差異不具有統(tǒng)計學意義，均高于空白對照組(P＜0.05)。胃液中特異性sIgA結(jié)果顯示：經(jīng)口途徑與經(jīng)直腸途徑所引起的胃黏膜局部的免疫應答均高于經(jīng)鼻途徑與空白

15、對照組，兩者之間的差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。糞便提取物中特異性sIgA結(jié)果顯示：三種免疫途徑之間的差異不具有統(tǒng)計學意義，均高于空白對照組(P＜0.05)。各組小鼠的保護率不同：rUreB、rOmp11聯(lián)合免疫佐劑經(jīng)口免疫組為70％(7/10)，rUreB、rOmp11聯(lián)合免疫佐劑經(jīng)鼻腔免疫組為50％(5/10)，rUreB、rOmp11聯(lián)合免疫佐劑經(jīng)直腸免疫組為90％(9/10)，空白對照組為0％(0/10)，各組之間的差異有

16、統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 4.不同抗原及佐劑組合的免疫應答及免疫保護效果不同抗原及佐劑組合所引起的黏膜局部及系統(tǒng)免疫應答結(jié)果之間的差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 結(jié)論1.通過對基因工程重組菌TB1(pMAL-c2X-omp11)、TB1(pMAL-c2X-ureB)的誘導、表達、純化，得到了純度較高、具有良好免疫反應性的幽門螺桿菌重組抗原rUreB、rOmp11；通過優(yōu)化重組菌TB1(pMAL-c2X-mlt)

17、的誘導表達條件，使大腸桿菌不耐熱腸毒素無毒突變體mLT63得以高效表達，并純化得到了具有良好免疫反應性的無毒的黏膜免疫佐劑。 2.采用Hp亞單位抗原rUreB、rOmp11單純混合聯(lián)合黏膜免疫佐劑mLT63經(jīng)3種黏膜途徑免疫BALB/c小鼠，評價了不同免疫途徑所產(chǎn)生的免疫應答及免疫保護效果。研究發(fā)現(xiàn)，三種黏膜途徑均可引起針對抗原的全身及黏膜局部的特異性免疫應答，并能夠顯著減少Hp的定植。 3.應用小鼠動物模型，對比研究了