玉米大斑病菌Homeobox基因家族的全基因組鑒定與轉(zhuǎn)錄因子StSte12的關(guān)系研究.pdf

1、本實驗室已經(jīng)克隆了玉米大斑病菌Fus3/Kss l-homolog途徑下游的轉(zhuǎn)錄因子基因StSTE12，生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)它具有轉(zhuǎn)錄因子所特有的STE homeodomain與ZnF_C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，同時采用RNAi技術(shù)獲得了StSTE12基因沉默轉(zhuǎn)化子，進一步研究發(fā)現(xiàn)StSTE12基因在調(diào)控玉米大斑病菌附著胞發(fā)育及侵染過程中發(fā)揮重要作用，但是該基因調(diào)控的下游靶基因尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn):酵母中STE12基因可以通過調(diào)控Homeob

2、ox基因表達，然后由Homeobox基因產(chǎn)物再調(diào)控更多功能基因的表達來調(diào)節(jié)酵母的生長發(fā)育。本研究試圖通過生物信息學(xué)方法分析出玉米大斑病菌基因組中Homeobox基因家族基因的數(shù)量、種類、基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特點，采用Real-time PCR技術(shù)檢測該家族基因在玉米大斑病野生型和StSTE12基因RNAi轉(zhuǎn)化子中的表達水平，推測哪些基因可能受到StSte12的調(diào)控。主要研究結(jié)果如下:
　　1、生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，玉米大斑病菌基因

3、組中存在8個Homeobox家族基因，分別命名為StHTF1、StHTF2、StHTF3、StHTF、StHTF5、StHTF6、StHTF7和StHTF8。
　　2、Homeobox家族成員散布在玉米大斑病菌基因組的6個scaffold鏈上，多數(shù)基因位于DNA負鏈上;各基因均含有內(nèi)含子，數(shù)量為1～3個;這8個基因所編碼的蛋白質(zhì)均含有保守的同源異型盒結(jié)構(gòu)域(Homeodomain)，且位于各個蛋白的不同位置。
　　3、從構(gòu)建

4、的系統(tǒng)發(fā)育樹中可以發(fā)現(xiàn):玉米大斑病菌的Homeodomain蛋白可以和其他真菌的Homeodomain蛋白聚類，表明不同真菌的Homeobox家族同源基因在氨基酸水平上呈現(xiàn)出高度的相似性。同時根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域分析，該家族基因可以分為4個類群。
　　4、通過預(yù)測Homeodomain蛋白的高級結(jié)構(gòu)，可知該家族蛋白都具有螺旋—轉(zhuǎn)角—螺旋(Helix-Turn-Helix)空間結(jié)構(gòu)，與保守基序分析結(jié)果相符。
　　5、利用Real-t

5、ime PCR技術(shù)，分析了玉米大斑病菌野生型菌株Homeobox家族基因在分生孢子萌發(fā)、附著胞發(fā)育以及侵染過程中的表達量變化情況，結(jié)果表明，在分生孢子萌發(fā)時期(3 hpi)、附著胞形成初期(6 hpi)、附著胞成熟時期(12 hpi)以及侵入絲形成時期(24 hpi)，8個基因的表達都顯著低于0h的表達水平(p＜0.05)。說明Homeobox轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族基因表達不利于病菌分生孢子萌發(fā)、附著胞發(fā)育以及隨后的侵染過程。
　　6、

6、采用Real-time PCR技術(shù)，檢測了玉米大斑病菌野生型及StSTE12基因沉默轉(zhuǎn)化子中Homeobox家族8個基因相對表達量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在附著胞形成時期8個基因在轉(zhuǎn)化子中的表達量均顯著高于野生型。說明StSTE12基因沉默可解除對這8個基因表達的抑制。
　　7、以pBARKS1-GFP質(zhì)粒為回復(fù)載體，構(gòu)建了StSTE12基因的表達載體HF-StSTE12，轉(zhuǎn)化野生型原生質(zhì)體，利用草胺膦抗性及RT-PCR篩選初步得到了2株