TRAF6在anti-β2GPI-β2GPI誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)TF中的作用及機(jī)制初探.pdf

1、研究目的:
　　 本課題組前期研究揭示,Toll樣受體4(Toll-like receptor4,TLR4)及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了抗磷脂抗體／抗原復(fù)合物(anti-beta-2-glycoproteinⅠ／beta-2-glycoproteinⅠ,anti—β2GPI／β2GPI)誘導(dǎo)人單核細(xì)胞株THP-1表達(dá)組織因子(tissue factor,TF)的過(guò)程,且部分依賴(lài)膜聯(lián)蛋白A2(Annexin A2,ANX2),成為抗磷脂

2、綜合征(antiphospholipid syndrome,APS)血栓形成的機(jī)制之一。本論文重點(diǎn)探討TLR4引發(fā)的信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子-腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor6,TRAF6)在此過(guò)程中的作用及可能的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 (1)利用實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-

3、qPCR)檢測(cè)anti-β2GPI／β2GPI誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞TF mRNA的表達(dá),采用TF活性測(cè)定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞TF活性。
　　 (2)RT-qPCR、Western蛋白印跡、免疫共沉淀檢測(cè)anti-β2GPI／β2GPI誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)TRAF6水平及其活化形式。
　　 (3)用蛋白酶體途徑抑制物-MG-132預(yù)處理THP-1細(xì)胞,觀察anti-β2GPI／β2GPI對(duì)THP-1細(xì)胞TRAF6和TF表達(dá)的影響

4、。
　　 (4)RT-qPCR、Western蛋白印跡檢測(cè)anti—β2GPI／β2GPI對(duì)TRAF6相關(guān)調(diào)控蛋白(TRAF4及鋅指蛋白A20)的表達(dá)。
　　 (5)利用本課題組已有的ANX2 RNA干擾慢病毒(LV-RNAi-ANX2)感染THP-1細(xì)胞、TLR4／MD-2途徑抑制物--紫杉醇(paclitaxel)以及白介素-1受體相關(guān)激酶1／4阻斷劑(IL-1 receptor-associatedkinase1／

5、4 inhibitor,IRAK1／4 inhibitor)預(yù)處理THP-1細(xì)胞,觀察對(duì)TRAF6、TRAF4及A20蛋白表達(dá)的影響。
　　 研究結(jié)果:
　　 (1)Anti-β2GPI／β2GPI(100μg／mL)能夠刺激THP-1細(xì)胞表達(dá)TFmRNA及活性,與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)。
　　 (2)Anti-β2GPI／β2GPI(100μg／mL)使THP-1細(xì)胞TRAF6 mRNA和蛋白(總蛋白

6、和泛素化的蛋白)表達(dá)均增加,并顯示時(shí)間相關(guān)性,分別在刺激15 min和30 min時(shí)表達(dá)至高峰。
　　 (3)MG-132(5μmol／L)明顯抑制anti—β2GPI／β2GPI對(duì)THP-1細(xì)胞TRAF6 mRNA和蛋白的刺激效應(yīng)及TF的誘導(dǎo)表達(dá)。
　　 (4)Anti-β2GPI／β2GPI(100μg／mL)刺激THP-1細(xì)胞后,TRAF4和A20 mRNA水平均增高,于刺激15 min達(dá)高峰。TRAF4蛋白表達(dá)在

7、30 min時(shí)達(dá)到高峰,后逐漸降低,而A20蛋白顯示逐漸升高,持續(xù)至12 h。
　　 (5)LV-RNAi-ANX2感染的THP-1細(xì)胞TRAF6蛋白表達(dá)降低,與未干擾相比差異顯著(P<0.05)；0.1μmol／L-1μmol／L紫杉醇能抑制TRAF6和TRAF4以及A20的刺激效應(yīng)；不同濃度IRAK1／4 inhibitor可以干預(yù)TRAF6、TRAF4及A20蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 (1)單核細(xì)胞

8、株THP-1經(jīng)anti-β2GPI／β2GPI刺激后,信號(hào)分子TRAF6被誘導(dǎo)表達(dá)并發(fā)生泛素化,最終促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)TF,從而參與APS血栓形成機(jī)制；MG-132可以干預(yù)TRAF6和TF的表達(dá),為APS血栓形成的預(yù)防及治療提供新思路。
　　 (2)在anti-β2GPI／β2GPI誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)TF所涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中,TRAF6作為關(guān)鍵分子而發(fā)揮作用,ANX2、TLR4／MD-2、IRAKs為其上游信號(hào)分子,而TRAF4