金雀異黃素對(duì)培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用及機(jī)制的研究.pdf

1、視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)具有許多生物學(xué)功能，對(duì)視網(wǎng)膜完整性和正常功能的維持起著重要作用。RPE細(xì)胞和Bruch's膜連接的破壞會(huì)導(dǎo)致具有特征性的病理學(xué)后果。視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層中的感光細(xì)胞層和RPE細(xì)胞連接的破壞，可以導(dǎo)致光感受器功能受損。RPE細(xì)胞和脈絡(luò)膜連接的破壞導(dǎo)致增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy， PVR)<'[1]>。在糖尿

2、病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)、視網(wǎng)膜脫離及視網(wǎng)膜脫離復(fù)位術(shù)后、眼外傷和炎癥性眼病損傷修復(fù)過(guò)程中，PVR是最棘手的的并發(fā)癥之一<'[1]>。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，RPE細(xì)胞的移行、增殖是PVR形成的主要原因<'[2，3]>。PVR早期的發(fā)病機(jī)制包括RPE細(xì)胞的增殖，正常休眠和分化的RPE細(xì)胞與Bruch's膜的分離、增殖，最終導(dǎo)致PVR。因此，抑制RPE細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，為研究增生性視網(wǎng)膜疾病的發(fā)病機(jī)制和

3、治療提供可能性。金雀異黃素(genistein，Gen)是大豆異黃酮的主要成分，可以通過(guò)多種機(jī)制最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。它打破了細(xì)胞周期G1/S的轉(zhuǎn)換，在G2/M期阻滯細(xì)胞周期的循環(huán)和誘導(dǎo)各種細(xì)胞凋亡<'[4-7]>。據(jù)報(bào)道，Gen是一種安全有效的藥物，對(duì)于上皮細(xì)胞，IC<,50>(半數(shù)抑制濃度)為12.5uM，LC<,50>(半數(shù)致死濃度)>300uM<'[8,9]。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Gen長(zhǎng)期口服，可以有效的改善實(shí)驗(yàn)性視網(wǎng)膜病變的生化、組

4、織病理和形態(tài)學(xué)改變<'[10-13]>。引。為了研究Gen對(duì)PVR的作用，我們體外培養(yǎng)RPE細(xì)胞，研究Gen對(duì)RPE細(xì)胞的作用并探討其作用機(jī)制。 目的： 人RPE細(xì)胞在視網(wǎng)膜病理、生理過(guò)程中扮演著重要角色。RPE細(xì)胞的移行、增殖導(dǎo)致RPE細(xì)胞和神經(jīng)上皮層連接的破壞，從而導(dǎo)致PVR。我們研究Gen對(duì)培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，并探討其作用機(jī)制。 方法： 體外用Gen處理RPE細(xì)胞(特指ARPE-19)

5、。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，用不同濃度的Gen(0、25、50、100、200umol/L)處理RPE細(xì)胞24h。光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。為了研究Gen導(dǎo)致的生長(zhǎng)抑制的機(jī)制，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期；PI、Annexin V-FITC雙染色分析細(xì)胞凋亡。Gen處理RPE細(xì)胞后，MAPK信號(hào)通路是變化最顯著的指標(biāo)之一。Western blot方法檢測(cè)MAPK通路的激活。 結(jié)果： 正常培養(yǎng)的APRE-19細(xì)胞呈扁平多

6、角形，胞質(zhì)內(nèi)有少量色素顆粒，細(xì)胞無(wú)色透明。加入不同濃度的Gen 24h后，對(duì)照組相比： (1)細(xì)胞體積縮小，胞漿濃縮，密度增加，部分脫落呈懸浮狀。 (2)RPE細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，生長(zhǎng)抑制率明顯增高，分別為6.44±2.0、14.71±0.8、28.97±1.5、45.75±0.9，且隨著Gen濃度的增大，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)更加明顯，呈劑量依賴(lài)性。 (3)細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，G2/M期細(xì)胞增多，G1期細(xì)胞減

7、少，伴隨S期和凋亡細(xì)胞增多，呈劑量依賴(lài)性，表現(xiàn)出G2/M期阻滯。 (4)細(xì)胞凋亡率明顯增高，分別為(16.87±1.3)％、 (19.44±0.9)％、(23.14±2.4)％、(34.81±2.8)％，隨著Gen濃度的增高，誘導(dǎo)凋亡作用增強(qiáng)，呈劑量依賴(lài)性。 (5)p-ERK1/2表達(dá)下調(diào)，p-p38表達(dá)下調(diào)，未檢測(cè)出p-JUK和p-BMK1的表達(dá)。ERK1/2的激活與Gen誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)，p38的激活與凋亡可能