Prohibitin在膽固醇規(guī)律前列腺癌PC-3細(xì)胞周期作用研究.pdf

1、前列腺癌（prostatecancerPCa）是威脅男性健康的常見腫瘤之一。在美國男性，前列腺癌是最常見的非上皮性腫瘤和第二位致死性的腫瘤。僅2006年就有234，460例新發(fā)病例，及將近30，000例死亡，占所有男性腫瘤的1/3。我國前列腺癌發(fā)病率也逐年升高，目前已位居男性泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤第三位。由于前列腺位置隱蔽，臨床癥狀不典型，就診時患者往往已是失去前列腺根治手術(shù)指證晚期患者。對這些晚期患者治療手段主要是通過藥物或外科手術(shù)阻斷雄激

2、素療法（ADT），然而，這些治療方法卻伴隨著許多副作用，例如骨質(zhì)疏松癥和心血管疾病。ADT通常只能提供暫時的緩解，約30％患者會復(fù)發(fā)并更難治和更加惡性的疾病，進(jìn)展為雄激素非依賴性前列腺癌（AIPC）。 近年來研究表明，高脂肪/膽固醇等“西方飲食”同前列腺癌的發(fā)病和進(jìn)展密切相關(guān)。高血清膽固醇水平能夠促進(jìn)前列腺癌的發(fā)展并且導(dǎo)致對于雄激素刺激上調(diào)，通過改變飲食及藥物降低血清膽固醇水平將有助于減緩前列腺癌的進(jìn)展。 我們的體外實驗

3、研究證實在低膽固醇水平條件下促進(jìn)prohibitin（PHB）蛋白表達(dá)上調(diào)?；蛐蛄型捶治鲎C實了PHB多個位點和固醇調(diào)節(jié)元件SREs高度序列同源。SREs存在于膽固醇規(guī)律基因中，提示PHB可能對固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBPs）活性敏感。PHB基因廣泛存在于細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)和線粒體，是一種有效的腫瘤抑制基因，具有高度的保守性，因其具有明顯的抗細(xì)胞增殖，抗腫瘤而得名。PHB基因的表達(dá)產(chǎn)物PHB蛋白的氨基酸結(jié)構(gòu)非常保守，是一類新型的分子伴

4、侶蛋白。PHB在規(guī)律細(xì)胞周期循環(huán)，介導(dǎo)信號傳遞，抗增殖、抗凋亡和抗衰老中發(fā)揮著非常重要的作用，但具體的分子機(jī)制尚未完全闡明。PHB是否是阻止前列腺癌細(xì)胞通過細(xì)胞循環(huán)轉(zhuǎn)錄的主要膽固醇敏感因子，以及在低膽固醇條件下是否是通過PHB上調(diào)作用抑制前列腺癌細(xì)胞增殖目前尚無相關(guān)報道。 本研究采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）、Real-timePCR、2DEWestern-blot檢測分別培養(yǎng)于普通培養(yǎng)基（NM）和膽固醇耗竭培養(yǎng)

5、液（CDM）中的前列腺癌PC-3細(xì)胞中PHB的mRNA和蛋白水平變化；并進(jìn)一步轉(zhuǎn)染PHB啟動基因到前列腺癌PC-3細(xì)胞中，采用免疫熒光檢測在低膽固醇水平條件下，PHB表達(dá)是否增強(qiáng)；同時進(jìn)行一系列基因片段切除，分離出約200bp膽固醇敏感啟動元件，確定類似于SREs位點并進(jìn)行點突變；進(jìn)一步采用siRNA基因沉默PC-3中的PHB，確定在CDM條件下，是否抑制PHB表達(dá)將允許細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)錄通過細(xì)胞循環(huán)，從而論證在PC-3細(xì)胞中PHB是膽固醇敏

6、感的細(xì)胞循環(huán)規(guī)律因子假說。初步揭示低膽固醇條件下通過上調(diào)PHB表達(dá)而抑制前列腺癌發(fā)展的分子機(jī)制，為治療前列腺癌提供新的思路。 第一章不同膽固醇水平條件下人前列腺癌PC-3細(xì)胞中PHB表達(dá)及意義 目的：研究比較分別培養(yǎng)于NM和CDM中人前列腺癌PC-3細(xì)胞PHBmRNA及蛋白的表達(dá)差異，分析膽固醇對PHB表達(dá)影響與前列腺癌發(fā)展關(guān)系。 方法：以人前列腺癌PC-3細(xì)胞系為研究對象，分別培養(yǎng)于NM和CDM中。培養(yǎng)液加入/

7、不加入血小板源性生長因子PDGF或EGF。顯微鏡下細(xì)胞計數(shù)，半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）、Real-timePCR檢測PHB的mRNA變化。2-DE和Western-blot檢測PHB蛋白。 結(jié)果： 1.培養(yǎng)于CDM的前列腺癌PC-3細(xì)胞數(shù)目明顯少于培養(yǎng)于NM中細(xì)胞數(shù)目，給予PDGF或EGF到NM中顯著促進(jìn)PC-3細(xì)胞增殖，而加入CDM中則導(dǎo)致細(xì)胞死亡。兩者表達(dá)顯著性差異（p<0.05）。 2.培養(yǎng)

8、于CDM中的PC-3細(xì)胞PHBmRNA表達(dá)顯著高于培養(yǎng)于NM的細(xì)胞表達(dá)，兩者有顯著性差異（p<0.05）。 3.培養(yǎng)于CDM中的PC-3細(xì)胞PHB蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。 結(jié)論： 1.低膽固醇抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞體外增殖。 2.低膽固醇促進(jìn)前列腺癌PC-3細(xì)胞中PHBmRNA和PHB蛋白表達(dá)。 3.低膽固醇抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖和PHB表達(dá)上調(diào)有關(guān)。 第二章PHB啟動子中膽固醇敏感作用

9、位點研究 目的：確定PHB啟動子中對于膽固醇敏感的作用位點，探討PHB是膽固醇敏感的細(xì)胞循環(huán)規(guī)律因子的分子機(jī)制。 方法：轉(zhuǎn)染熒光素酶報告基因載體PGL3和PHB啟動子結(jié)合的熒光素報告質(zhì)粒到PC-3細(xì)胞，分別培養(yǎng)于LPDS實驗組和LPDS+CHO對照組中。Luciferase免疫熒光分析比較前列腺癌PC-3細(xì)胞中PHB表達(dá)差異；PCR擴(kuò)增、分段切除PHB啟動子，重復(fù)轉(zhuǎn)染和Luciferase熒光表達(dá)檢測，限定約200bp膽

10、固醇敏感啟動元件區(qū)域；找出該段區(qū)域中同源于SRE位點并進(jìn)行點突變，證實PHB啟動子中的膽固醇敏感調(diào)控位點同源于SRE。 結(jié)果： 1.Luciferase熒光檢測結(jié)果顯示，在完整的PHB啟動子轉(zhuǎn)染PPHB-1192組中，培養(yǎng)于LPDS中Luciferase熒光表達(dá)顯著高于培養(yǎng)于LPDS+CHO，兩者比較有顯著性差異（p<0.05）。 2.同完整的PHB啟動子轉(zhuǎn)染PPHB-1192組比較，PPHB-179組lucif

11、erase熒光表達(dá)顯著降低，兩者有顯著性差異（p<0.05）。PPHB-179中LPDS組和LPDS+CHO組Luciferase熒光表達(dá)無顯著性差異（p>0.05）。 3.點突變位于PHB啟動子上的-117到-108bp的SRE同源位點后，同PPHB-1192比較，SREMUT點突變組Luciferase熒光表達(dá)顯著降低，兩組比較有顯著性差異（p<0.05）。SREMUT點突變中LPDS組和LPDS+CHO組Luciferas

12、e熒光表達(dá)無顯著性差異（p>0.05）。 結(jié)論： 1.PHB表達(dá)受膽固醇調(diào)節(jié)。 2.PHB啟動子中對膽固醇敏感的作用位點位于-117到-108bp區(qū)間。 3.PHB啟動子對膽固醇敏感作用位點同源于SRE。 第三章PHB在人前列腺癌PC-3細(xì)胞中的作用機(jī)制研究 目的：觀察研究RNAi抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞中的PHB表達(dá)對細(xì)胞增殖、凋亡影響，探討PHB影響人前列腺癌進(jìn)展的可能作用機(jī)制。

13、 方法：SiRNA基因沉默PC-3細(xì)胞中PHB基因，AnnexinV/PI雙染和流式細(xì)胞計數(shù)觀察NM和CDM培養(yǎng)下分別給予血小板源性生長因子PDGF或EGF刺激的前列腺癌凋亡細(xì)胞數(shù)目差別；四甲基偶氮唑藍(lán)比色（MTT）檢測細(xì)胞增殖。 結(jié)果： 1.流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)，在siRNA抑制PC-3細(xì)胞中的PHB后，CDM實驗組細(xì)胞凋亡率顯著增加，同NM對照組比較有顯著性差異（p<0.05）；CDM組給予PDGF或EGF后，細(xì)胞凋亡

14、率升高，與NM對照組相比較有顯著性差異（p<0.05）。 2.MTT檢測細(xì)胞增殖發(fā)現(xiàn)，在NM組內(nèi)，給予PDGF或EGF刺激72小時后，同對照組NegativeRNAi相比較，PHBRNAi實驗組細(xì)胞增殖顯著增加，兩者比較有顯著性差異（p<0.05）。同20ng/mlPDGF或EGF相比較，給予40ng/mlPDGF或EGF刺激后，細(xì)胞增殖有增加趨勢。在CDM組內(nèi)，給予PDGF或EGF刺激72小時后，同對照組NegativeRNA