動(dòng)物源性糞腸球菌ebp菌毛基因的保守性及其多克隆抗體的制備.pdf

1、糞腸球菌是醫(yī)院內(nèi)和動(dòng)物感染的重要病原體，對(duì)人、畜健康和食品安全構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。一般認(rèn)為腸道表皮屏障是細(xì)菌性病原體侵入的優(yōu)先入口，黏附并定植到腸上皮細(xì)胞是其感染的關(guān)鍵步驟。菌毛在革蘭氏陰性和陽(yáng)性細(xì)菌的感染中起著關(guān)鍵的作用，但動(dòng)物源性糞腸球菌ebp菌毛基因的攜帶情況、保守性以及它的致病作用還不清楚。本研究通過對(duì)動(dòng)物源性糞腸球菌的ebp基因分布情況、保守性進(jìn)行分析，并原核表達(dá)ebp菌毛蛋白，制備高效價(jià)、高特異性的多克隆抗體，以分析其致病作用和

2、免疫原性，從而為動(dòng)物源性糞腸球菌感染的預(yù)防和治療打下良好的基礎(chǔ)。
　　使用Nallapareddy等人所描述的引物，采用PCR方法對(duì)2006年至2011年間從河南省不同地區(qū)分離的50株動(dòng)物源性糞腸球菌ebp基因的攜帶情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示50株動(dòng)物源性糞腸球菌全部攜帶ebpABC基因。再根據(jù)GenBank上已發(fā)表的糞腸球菌OG1RF株的ebp基因序列，使用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)ebpABC全基因引物，對(duì)10株動(dòng)物源

3、性糞腸球菌ebp菌毛蛋白的編碼基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化回收，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。然后應(yīng)用DNASTAR（5.0版本）軟件將測(cè)定出的10株動(dòng)物源性糞腸球菌的ebp基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，并與糞腸球菌OG1RF株的ebp基因序列進(jìn)行比較，結(jié)果顯示測(cè)定的10株動(dòng)物源性糞腸球菌之間ebpA、ebpB和ebpC基因DNA序列的同源性分別為98.0％-100%、98.8

4、%-100%和99.0%-100%，所推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性分別為98.4%-100%、98.2%-100%和98.7%-100%。10株菌與GenBank上已發(fā)表的人臨床糞腸球菌OG1RF株相比，ebp基因DNA序列的同源性為98.2%-99.7%，所推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性為98.5%-99.8%。由此可見，ebp基因在動(dòng)物源性糞腸球菌中廣泛分布且高度保守，并且與人源糞腸球菌的同源性也較高。
　　使用生物信息學(xué)軟件對(duì)糞腸球菌

5、EbpA蛋白和EbpC蛋白的抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，綜合各軟件的分析結(jié)果后將ebpA基因分成3段來表達(dá)，分別命名為ebpA1、ebpA2和ebpA3，將ebpC基因分成2段來表達(dá)，分別命名為ebpC1和ebpC2。然后，根據(jù)GenBank上已發(fā)表的糞腸球菌OG1RF株的ebpA和ebpC基因序列，設(shè)計(jì)5對(duì)帶有合適酶切位點(diǎn)的引物，以提取的豬源糞腸球菌N9株的基因組DNA為模板分別擴(kuò)增出ebpA1、ebpA2、ebpA3、ebpC1和ebpC2基

6、因片段，大小分別為1167 bp、1098 bp、963 bp、981 bp和891 bp，擴(kuò)增ebpB基因（ EF1092A）所使用的引物引用Jouko Sillanpaa等人所描述的（酶切位點(diǎn)有改動(dòng)），目的片段大小為1233 bp。將所擴(kuò)增出的6個(gè)基因片段分別克隆到原核表達(dá)載體pET-28a中，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-ebpA1、pET-28a-ebpA2、pET-28a-ebpA3、pET-28a-ebpC1、pET-2

7、8a-ebpC2和pET-28a-EF1092A（ebpB），經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證6個(gè)重組質(zhì)粒均構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌大腸桿菌BL21(DE3)中，在IPTG的誘導(dǎo)下均成功表達(dá)，獲得了分子量大小分別約為46.7 kDa、45.0 kDa、39.4 kDa、39.3 kDa、36.0 kDa和50.0 kDa的重組蛋白，與預(yù)期的目的蛋白分子量相符。通過優(yōu)化表達(dá)條件，大量表達(dá)重組蛋白，用尿素法和鎳柱對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化獲得了高純度的重組蛋白

8、。
　　使用6種已純化的重組蛋白作為免疫原分別免疫新西蘭大白兔，制備抗重組蛋白的多克隆抗體，經(jīng)雙向免疫瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià)分別為1:16、1:8、1:32、1:32、1:64和1:64。將多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡，結(jié)果顯示制備的多抗可以與各自的重組蛋白特異性結(jié)合。而且，在多克隆抗體阻止野生菌株的生物膜生成實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)抗EbpA3蛋白IgG的終濃度為0.1875 mg/mL時(shí)，糞腸球菌N9株的生物膜生成量最少，此數(shù)值與陰性對(duì)照值差異