吉西他濱、培美曲塞及埃羅替尼聯(lián)合對人胰腺癌細(xì)胞BXPC-3及PANC-1生長的影響及機(jī)制探討.pdf

1、胰腺癌是一種惡性程度極高的消化道腫瘤，近年來發(fā)病率有上升趨勢。全世界每年約20萬人死于胰腺癌。其惡性程度高，進(jìn)展快，且具有發(fā)現(xiàn)晚、病程短、轉(zhuǎn)移早、預(yù)后差等特點(diǎn)，被稱為“癌中之王”。在確診時，只有不到10%的胰腺癌是可以切除的，5年存活率小于5%，在所有癌癥中5年生存率最低。胰腺癌細(xì)胞具有特殊的生物學(xué)特性，除吉西他濱外對其他化療不甚敏感。雖然美國NCCN和歐洲ESMO臨床指南均把吉西他濱作為轉(zhuǎn)移性胰腺癌的一線化療藥物，但對提高轉(zhuǎn)移性胰腺癌

2、的作用仍有限，轉(zhuǎn)移性胰腺癌吉西他濱治療后中位生存期僅5.65月，1年生存率僅為16%～19%。為進(jìn)一步提高吉西他濱治療晚期胰腺癌的效果，許多藥物與吉西他濱聯(lián)合治療晚期胰腺癌，包括5-氟尿嘧啶、順鉑、卡培他濱、多西紫杉醇等。雖然聯(lián)合化療的有效率得到一定提高，腫瘤相關(guān)癥狀也有一定的改善，但上述藥物與吉西他濱聯(lián)合的大規(guī)模隨機(jī)臨床研究都未能顯示出比吉西他濱單藥具有更好的生存獲益，胰腺癌的化療走到了一個平臺期，如何實(shí)現(xiàn)治療效果上的突破是國內(nèi)、外腫

3、瘤界面臨的一個嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。 分子靶向治療針對細(xì)胞內(nèi)或表面特定分子，特異性強(qiáng)，不良反應(yīng)少，是目前腫瘤治療的一個研究熱點(diǎn)。表皮生長因子受體（EGFR）是受體ErbB家族的一員，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、提高腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動、黏著和侵襲能力，從而增加腫瘤向周邊及遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)會，研究表明EGFR的過表達(dá)影響胰腺癌細(xì)胞的生長。埃羅替尼是小分子酪氨酸激酶機(jī)制劑（EGFR-TKIs），一項(xiàng)埃羅替尼聯(lián)合吉西他濱治療進(jìn)展性胰腺癌的Ⅲ期

4、臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，與單藥吉西他濱相比，埃羅替尼聯(lián)合吉西他濱的中位生存期明顯延長（6.24月vs5.91月，p=0.034）；1年生存率分別為23%和17%。2005年11月美國FDA批準(zhǔn)埃羅替尼用于晚期胰腺癌一線治療。埃羅替尼聯(lián)合吉西他濱雖提高了生存期，但中位生存時間及1年生存率提高有限，如何提高分子靶向藥物和化療聯(lián)合治療晚期胰腺癌的療效是醫(yī)學(xué)界面臨的問題。EGFR-TKIs與化療序貫用藥治療非小細(xì)胞肺癌優(yōu)于同時給藥，對胰腺癌，二者序貫

5、用藥是否優(yōu)于同時給藥目前國內(nèi)外缺乏基礎(chǔ)和臨床研究結(jié)果。本研究的第一個目的是探討吉西他濱與埃羅替尼不同用藥時序聯(lián)合對人胰腺癌細(xì)胞BXPC-3及PANC-1生長是否具協(xié)同作用，并從細(xì)胞周期角度分析其可能的細(xì)胞學(xué)機(jī)制。 培美曲塞是多靶點(diǎn)抗葉酸合成的藥物，基礎(chǔ)研究顯示培美曲塞能抑制胰腺癌細(xì)胞PANC-1的增值，Ⅱ期的臨床研究表明，培美曲塞對晚期胰腺癌療效突出，且副作用小，與吉西他濱聯(lián)合對抑制胰腺癌細(xì)胞生長具協(xié)同作用。另外，鑒于培美曲塞與

6、埃羅替尼聯(lián)合應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌存在時序效應(yīng)，在胰腺癌未見類似報(bào)道，本研究第二個目的是探討培美曲塞分別與吉西他濱及埃羅替尼不同用藥時序聯(lián)合對人胰腺癌細(xì)胞BXPC-3及PANC-1生長是否具協(xié)同作用，并從細(xì)胞周期角度分析其可能的細(xì)胞學(xué)機(jī)制，為臨床更好的治療晚期胰腺癌提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。 第一部分 EGFR mRNA及蛋白在BXPC-3及PANC-1細(xì)胞中的表達(dá)。 四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測兩株細(xì)胞生長，RT-PCR法和W

7、estern blot法分別檢測兩株細(xì)胞中EGFRmRNA及蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，相關(guān)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05判定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示： 1.兩株細(xì)胞在接種后第2-7天呈對數(shù)生長，此階段最適合進(jìn)行細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)。 2.兩株細(xì)胞均有EGFRmRNA及蛋白表達(dá)。 3.BXPC-3細(xì)胞EGFRmRNA（t=9.571，P=0.001）及蛋

8、白（t=10.935，P=0.000）表達(dá)量高于PANC-1細(xì)胞。 第二部分吉西他濱、培美曲塞及埃羅替尼聯(lián)合對BXPC-3及PANC-1細(xì)胞生長的影響。 MTT比色法檢測兩株細(xì)胞生長。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，相關(guān)數(shù)據(jù)采用，SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)；多組之間比較采用one-way ANOVA方差分析，而后不同組間比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05判定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示：

9、 1.吉西他濱（3×10-10～3×10-2mol/L）明顯抑制兩株細(xì)胞的生長，作用呈濃度依賴性（F=86.765，P=0.000； F=85.260，P=0.000）和時間依賴性（F=135.385，P=0.000； F=134.132，P=0.000）；培美曲塞（1.7×10-10～1.7×10-2mol/L）明顯抑制兩株細(xì)胞的生長，作用呈濃度依賴性（F=70.120，P=0.000；F=81.573，P=0.000）和時間依

10、賴性（F=70.025，P=0.000； F=56.772，P=0.000）；埃羅替尼（10-6～104 mol/L）明顯抑制兩株細(xì)胞的生長，作用呈濃度依賴性（F=22.180，P=0.000； F=15.517，P=0.000）和時間依賴性（F=44.354，P=0.000； F=7.813，P=0.000）。吉西他濱（3×10-9～3×106mol/L）（t=2.821，P=0.018；t=2.146，P=0.048； t=2.27

11、4，P=0.046； t=2.278，P=0.046）、培美曲塞（1.7×104～1.7×10-2 mol/L）（t=3.120，P=0.011； t=2.677，P=0.038；t=2.440，P=0.035）及埃羅替尼（10-6～10-4 mol/L）（t=3.390，P=0.008；t=3.896，P=0.005；t=5.777，P=0.000）對EGFRmRNA及蛋白高表達(dá)的BXPC-3細(xì)胞抑制作用均強(qiáng)于EGFRmRNA及蛋白低

12、表達(dá)的PANC-1細(xì)胞。吉西他濱抑制BXPC-3及PANC-1細(xì)胞生長的IC50值分別為31.57±1.79μmol/L和59.17±1.78μmol/L。培美曲塞抑制BXPC-3及PANC-1細(xì)胞生長的IC50分別為39.86±1.68μmol/L和83.76±1.75μmol/L。埃羅替尼對BXPC-3及PANC-1細(xì)胞的抑制作用在10-6～10-4 mol/L濃度范圍未達(dá)50%，未能得出IC50值。 2.三種藥物不同用藥時

13、序聯(lián)合對兩株細(xì)胞生長的影響與給藥次序有關(guān)，吉西他濱與埃羅替尼同時給藥（P=0.034；P=0.049）或先用埃羅替尼后用吉西他濱（P=0.001； P=0.025）對兩株細(xì)胞的抑制作用都顯著增強(qiáng)；埃羅替尼與培美曲塞同時給藥（P=0.016；P=0.049）和24h序貫給藥（P=0.000；P=0.000）對兩株細(xì)胞的抑制作用都顯著增強(qiáng)，其中以先用培美曲塞24h后用埃羅替尼對兩株細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)（P=0.038； P=0.029）；吉西

14、他濱與培美曲塞同時給藥（P=0.049；P=0.044）和24h序貫給藥（P=0.000；P=0.000）對兩株細(xì)胞的抑制作用都顯著增強(qiáng)，其中以先用培美曲塞24h后用吉西他濱對兩株細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)（P=0.038；P=0.022）。 第三部分吉西他濱、培美曲塞及埃羅替尼對BXPC-3細(xì)胞周期的影響。 流式細(xì)胞術(shù)測細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，相關(guān)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，多組之間比較采用o

15、ne-way ANOVA方差分析，而后不同組間比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05判定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示： 1.與對照組相比，吉西他濱單藥及埃羅替尼單藥、吉西他濱與埃羅替尼同時給藥及序貫用藥均將BXPC-3細(xì)胞周期阻斷在G1期（P=0.002）；埃羅替尼與培美曲塞同時給藥（P=0.046）及先用埃羅替尼后用培美曲塞（P=0.004）將BXPC-3細(xì)胞周期阻斷在G1期，先用培美曲塞后用埃羅替尼將BXPC-3細(xì)胞周期阻止在S期

16、（P=0.026）；培美曲塞單藥（P=0.025）及先用培美曲塞后用吉西他濱（P=0.001）將BXPC-3細(xì)胞周期阻止在S期，先用吉西他濱后用培美曲塞（P=0.003）及吉西他濱與培美曲塞同時給藥（P=0.048）將BXPC-3細(xì)胞周期阻止在G1期。 結(jié)論：兩株細(xì)胞均有EGFRmRNA及蛋白表達(dá)，BXPC-3細(xì)胞EGFRmRNA及蛋白表達(dá)量高于PANC-1細(xì)胞。吉西他濱、培美曲塞及埃羅替尼呈濃度依賴性和時間依賴性抑制兩株細(xì)胞生

17、長，且對EGFRmRNA及蛋白高表達(dá)的BXPC-3細(xì)胞抑制作用強(qiáng)于EGFRmRNA及蛋白低表達(dá)的PANC-1細(xì)胞。三種藥物不同用藥時序聯(lián)合對兩株細(xì)胞生長的影響與給藥次序有關(guān)，吉西他濱與埃羅替尼同時給藥或先用埃羅替尼后用吉西他濱對兩株細(xì)胞的抑制作用都顯著增強(qiáng)；吉西他濱（埃羅替尼）與培美曲塞同時給藥和24h序貫給藥對兩株細(xì)胞的抑制作用都顯著增強(qiáng)，其中以先用培美曲塞24h后用吉西他濱（埃羅替尼）對兩株細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)。先用培美曲塞后用吉西他