黃翅大白蟻中腸木質(zhì)纖維素降解相關(guān)酶類的序列分析與表達(dá)研究.pdf

1、白蟻是一種社會(huì)性昆蟲，在土壤的生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用，因此，白蟻又被稱為生態(tài)系統(tǒng)工程師。根據(jù)腸道共生物中是否存在原生動(dòng)物，可將白蟻分為低等白蟻和高等白蟻。而在分類學(xué)上，僅白蟻科為高等白蟻，但數(shù)目卻占全部白蟻的75％。相對(duì)于低等白蟻的研究，目前對(duì)高等白蟻木質(zhì)纖維素降解機(jī)制的研究還相對(duì)較少。
　　本文的研究材料黃翅大白蟻（Macrotermesbarneyi，Isoptera:Macrotermitidae）是一種與真菌共生高等培菌

2、白蟻，廣泛分布于我國(guó)南方。研究表明，不僅培菌白蟻的共生真菌具有木質(zhì)纖維素的降解能力，白蟻腸道內(nèi)存在的內(nèi)源性的纖維素酶，可能也在纖維素降解過程中發(fā)揮重要作用。我們實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)黃翅大白蟻腸道木質(zhì)纖維素降解酶活性研究發(fā)現(xiàn)，中腸的酶活性最高。中腸轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)為木質(zhì)纖維素降解酶的unigenes，包括:漆酶、β-葡萄糖苷酶、過氧化物酶、阿魏酸酯酶等等。為研究這些unigenes編碼蛋白的功能以及其在培菌白蟻木質(zhì)纖維素降解中發(fā)揮的作用，

3、本研究分別對(duì)上述四種酶進(jìn)行了基因克隆和表達(dá)研究，具體內(nèi)容如下:
　　對(duì)黃翅大白蟻中腸漆酶進(jìn)行基因組序列的擴(kuò)增，共擴(kuò)增得到長(zhǎng)約10kb的序列，其中共有8個(gè)內(nèi)含子，將外顯子分成9段。此外，在內(nèi)含子和外顯子區(qū)，各有一段序列因預(yù)測(cè)為二級(jí)結(jié)構(gòu)，所以未能測(cè)序成功。以基因組序列作為已知序列，進(jìn)行染色體步移，成功擴(kuò)增漆酶的3'側(cè)翼序列，該序列包含有預(yù)測(cè)為昆蟲來源的轉(zhuǎn)座子序列，證實(shí)該漆酶為昆蟲來源。為了對(duì)漆酶的酶活性質(zhì)進(jìn)行更好的分析，本論文同時(shí)嘗試

4、建立昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)漆酶進(jìn)行異源表達(dá)。結(jié)果顯示，表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建成功但是漆酶沒有表達(dá)。
　　對(duì)黃翅大白蟻中腸轉(zhuǎn)錄組測(cè)序預(yù)測(cè)的3條β-葡萄糖苷酶unigenes進(jìn)行分析，其中10737蛋白為GH30家族的來源，而10810和59997蛋白為GH1家族的來源。采用RACE方法成功擴(kuò)增3個(gè)含有完整開放讀碼框的基因，并對(duì)這三條基因的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析和誘導(dǎo)表達(dá)分析。序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，10810和59997具有GH1家族的保守結(jié)構(gòu)位點(diǎn)

5、，證實(shí)其為GH1家族蛋白;而10737的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)未知，僅預(yù)測(cè)為GH30家族蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析預(yù)測(cè)10810和59997蛋白都為昆蟲來源。異源表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，蛋白10810能夠在原核表達(dá)系統(tǒng)E.coli和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)GS115中表達(dá)但沒有活性。蛋白59997和10737在大腸桿菌和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中均不能表達(dá)，密碼子優(yōu)化后的10737cDNA能夠在大腸桿菌中表達(dá)，但是沒有檢測(cè)到活性。而優(yōu)化后的59997蛋白則仍舊沒有表達(dá)。將MbBG、

6、BG-10737、59997、10810在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，但westernblot并沒有檢測(cè)到信號(hào)，具體原因還需要進(jìn)一步的分析。
　　分別擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中預(yù)測(cè)為過氧化物酶(75774)與阿魏酸酯酶(82227)的cDNA序列，使用RACE法成功擴(kuò)增得到這兩條序列，但預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，75774為動(dòng)物過氧化物酶家族的無脊椎動(dòng)物的細(xì)胞黏附蛋白，預(yù)測(cè)其功能為參與細(xì)胞黏連;而預(yù)測(cè)為阿魏酸酯酶的82227序列則為酯酶脂肪酶超家族的保

7、幼激素酯酶，是參與昆蟲變態(tài)與發(fā)育的重要的酶。
　　總之，本研究擴(kuò)增得到漆酶的基因序列且證實(shí)該漆酶為昆蟲來源漆酶，但是該漆酶沒有在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。本文同時(shí)利用RACE的方法擴(kuò)增獲得3條預(yù)測(cè)為β-葡萄糖苷酶的cDNA全長(zhǎng)序列，并分別進(jìn)行了異源表達(dá)嘗試，其中10810蛋白和密碼子優(yōu)化后的10737蛋白都能夠進(jìn)行異源表達(dá)但沒有酶活性。此外，本研究還擴(kuò)增得到預(yù)測(cè)為過氧化物酶和阿魏酸酯酶的cDNA序列，但全長(zhǎng)序列分析結(jié)果表明這兩個(gè)