慢性髓系白血病急性變期特異miRNA的克隆及鑒定.pdf

1、慢性髓系白血病(CML)是一種骨髓造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病。病程進(jìn)展慢,臨床以發(fā)熱、脾腫大、外周血及骨髓中出現(xiàn)大量中幼、晚幼粒細(xì)胞等為特征。該病病程分為慢性期、加速期以及急性變期,在病程進(jìn)入急變期后,患者病情往往會(huì)出現(xiàn)迅速惡化,對(duì)藥物反應(yīng)差等特點(diǎn)。CML的分子發(fā)病機(jī)制現(xiàn)已基本闡明,即t(9；22)(q34；q11)染色體易位,這一改變導(dǎo)致了位于9q34斷裂區(qū)的ABL與22q11斷裂區(qū)的BCR形成BCR-ABL融合基因,后者具有異?；罨?/p>

2、酪氨酸蛋白激酶活性,通過(guò)激活一些細(xì)胞關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白的磷酸化和多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,如通過(guò)激活參與細(xì)胞增殖和分化調(diào)控的Ras-MAPK信號(hào)途徑,使造血干細(xì)胞增殖凋亡失控和分化異常。由于這一致病機(jī)制的明確,針對(duì)抑制酪氨酸激酶異?；罨男》肿影邢蛩幬?如伊馬替尼、達(dá)沙替尼等相繼問(wèn)世,使得CML患者的臨床完全緩解率或部分緩解率有了很大的提高。但是,有相當(dāng)一部分患者對(duì)于這些藥物出現(xiàn)原發(fā)耐藥,或者即使是藥物敏感的患者,在維持治療若干年后,最終會(huì)向加速期及

3、急性變期轉(zhuǎn)化,進(jìn)而使得病情惡化,并出現(xiàn)多藥耐藥現(xiàn)象。因此,進(jìn)一步深入探索CML病情進(jìn)展的分子機(jī)制對(duì)于CML的多靶點(diǎn)治療有著重要的意義。
　　 miRNA與多種腫瘤的發(fā)生密切關(guān)系。miRNA的長(zhǎng)度較短,因此獲得性或缺失性的功能突變的積累發(fā)生較少,各種突變、啟動(dòng)子的超甲基化或擴(kuò)增都很容易引起miRNA的激活或失活。miRNA通過(guò)調(diào)控tuRNA的轉(zhuǎn)譯或穩(wěn)定性來(lái)參與正常細(xì)胞穩(wěn)定狀態(tài)的維持,因此miRNA的異常表達(dá)則可能導(dǎo)致其相應(yīng)靶基因的

4、異常。miRNA活性喪失使靶基因過(guò)表達(dá),而miRNA激活則會(huì)導(dǎo)致靶基因下調(diào),這些可能涉及細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和血管發(fā)生等過(guò)程。miRNA既可作為抑癌基因,下調(diào)原癌基因的活性,也可作為癌基因,下調(diào)抑癌基因的活性。不同的細(xì)胞中,同樣的miRNA可能作為癌基因或抑癌基因,而且在某些特定的細(xì)胞中一個(gè)miRNA的靶基因往往不止一個(gè),而每一個(gè)靶基因又可能受多個(gè)miRNA的調(diào)控,組成了錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)各種基因進(jìn)行復(fù)雜的調(diào)控,參與腫

5、瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　 miRNA與血液病的發(fā)生密切相關(guān),研究表明miRNA-15和miRNA-1在某些類(lèi)型的白血病和淋巴瘤中發(fā)生了功能障礙,miRNA-15和miRNA-16定位在染色體13q14區(qū)段,研究發(fā)現(xiàn),65％的CLL患者攜帶miRNA-15和miRNA-16丟失或突變的癌細(xì)胞。慢性淋巴性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、套細(xì)胞淋巴瘤和前列腺癌中也常有該區(qū)段的丟失。這兩種miRNA通過(guò)抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過(guò)程,Bcl

6、-2蛋白主要通過(guò)作用于線(xiàn)粒體來(lái)實(shí)現(xiàn)其抑制凋亡的生物學(xué)活性,因此當(dāng)miRNA-15和miRNA-16丟失或突變時(shí),Bcl-2蛋白的表達(dá)量上調(diào),細(xì)胞凋亡受阻,最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。
　　 miRNA在CML的進(jìn)展中也有重要作用。在對(duì)CML患者和正常人的單個(gè)核細(xì)胞及CD34+細(xì)胞的157個(gè)miRNA進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn):miRNA-10a、miRNA-150及miRNA-151在CML患者體內(nèi)表達(dá)下降,而miRNA-96表達(dá)則增高。而在對(duì)正常人C

7、D34+細(xì)胞和CML患者CD34+細(xì)胞進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),CML慢性期miRNA-17-92家族過(guò)表達(dá),而急變期無(wú)過(guò)表達(dá)。約95％以上CML患者有ph染色體,其結(jié)果是在分子水平上形成BCR-ABL融合基因。也有研究表明BCR-ABL融合基因的表達(dá)也受到相關(guān)miRNA的影響,如miRNA-17-92、miRNA-203等。
　　 本研究分別以CML初發(fā)患者及CML急性變患者的骨髓原代細(xì)胞為研究對(duì)象,分別提取兩者的總RNA后,首先進(jìn)行小R

8、NA的富集,將收集到的小RNA分離后分別加poly(A)尾和5’接頭,然后將連有接頭及poly(A)尾的片段進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,所得到的初發(fā)患者及急性變患者的cDNA進(jìn)行本研究所自行發(fā)明的柱式消減雜交,首先將CML初發(fā)患者骨髓原代細(xì)胞中克隆的片段與尼龍膜結(jié)合,然后將CML急性變患者骨髓原代細(xì)胞克隆的片段與之進(jìn)行雜交,最后得到的片段則為CML急性變患者骨髓原代細(xì)胞所特有的片段。將這些特有的片段擴(kuò)增后做轉(zhuǎn)化,然后測(cè)序檢測(cè)克隆到的小RNA序列。

9、>　　 本實(shí)驗(yàn)中共隨機(jī)選取50個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序,獲得測(cè)序結(jié)果后對(duì)獲得的克隆序列進(jìn)行分析,結(jié)果顯示共有42個(gè)克隆條序列因重復(fù)或長(zhǎng)度不在miRNA理論范圍內(nèi),剩余的8條序列長(zhǎng)度在18-25bp之間,因此,可將這8條序列暫定為候選miRNA序列,暫命名為micro-A、micro-B、micro-C、micro-D、micro-E、micro-F、micro-G及micro-H。隨后進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證,以確定這8條序列是否為CML急性變患者骨髓

10、原代細(xì)胞中所特有的miRNA序列。
　　 目前對(duì)確定某小RNA是否為miRNA的標(biāo)準(zhǔn)首先是預(yù)測(cè)小RNA的前體是否具有典型的發(fā)夾結(jié)構(gòu),且小RNA是否處于發(fā)卡結(jié)構(gòu)的臂上,其次還需要對(duì)其進(jìn)行表達(dá)的分析,若小RNA序列能在相應(yīng)的物種中表達(dá),就可以判定此小RNA序列為miRNA序列。本研究中,首先對(duì)CML急性變患者骨髓原代細(xì)胞中克隆的8條候選miRNA進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,這8條序列都可在Genebank中找到各自的同源序列,并且經(jīng)過(guò)在m

11、iRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì),排除已知序列后顯示這8條序列均為未知序列,再經(jīng)過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件分析后表明,8條序列中的micro-B、micro-C、micro-D、micro-E、micro-F、micro-G及micro-H七條序列分別處于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖環(huán)上,而micro-A序列則位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的臂上。因此,經(jīng)過(guò)第一步的生物信息學(xué)分析判定micro-A是CML急性變患者骨髓原代細(xì)胞中特異的miRNA,而另7條則不是。
　　 對(duì)于初步判定

12、的micro-A還需進(jìn)一步檢測(cè)其表達(dá)情況來(lái)最后確定其是否為CML急性變患者骨髓原代細(xì)胞特異的miRNA。為了驗(yàn)證micro-A的表達(dá),我們采用總RNA加poly(A)尾RT-PCR法檢測(cè)這條序列在CML急性變患者骨髓原代細(xì)胞的表達(dá)情況,結(jié)果顯示該序列可表達(dá)。同時(shí)為了探明micro-A在CML初發(fā)患者骨髓原代細(xì)胞中是否也表達(dá),我們同樣做了CML初發(fā)患者骨髓原代細(xì)胞總RNA加poly(A)尾RT-PCR法的驗(yàn)證,結(jié)果沒(méi)檢測(cè)到micro-A在

13、CML初發(fā)患者骨髓原代細(xì)胞中的表達(dá)情況。因此,經(jīng)過(guò)序列分析及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后,本研究最后獲得一條CML急性變患者骨髓原代細(xì)胞所特有的miRNA,即micro-A。
　　 在今后的研究中,我們要對(duì)本研究中所克隆得到的miRNA做進(jìn)一步的功能研究,以揭示其與CML發(fā)生的關(guān)系及其在CML中的表達(dá)特征和功能意義,闡明CML中的RNA調(diào)控機(jī)制,使我們對(duì)CML急性變的病因及分子機(jī)制得到深入的認(rèn)識(shí),并發(fā)現(xiàn)以RNA分子為對(duì)象的治療靶標(biāo)和早期診斷標(biāo)識(shí),