多囊卵巢綜合征源性人胚胎干細(xì)胞建系、鑒定及意義.pdf

1、胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcells，ESCs）是由囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（innercellmass，ICM）或原始生殖細(xì)胞（primordialgermcells，PGCs）經(jīng)體外抑制分化培養(yǎng)后，分離出的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞。ESCs可保持未分化狀態(tài)在體外無(wú)限傳代培養(yǎng)，并保持正常的細(xì)胞核型，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境中可以分化成三個(gè)胚層來(lái)源的任何類型細(xì)胞，包括體細(xì)胞和生殖細(xì)胞。人胚胎干細(xì)胞（humanembryonicstemcells，hES

2、Cs）不僅能定向誘導(dǎo)分化成人體體細(xì)胞，用于細(xì)胞或組織器官移植，而且在研究物種發(fā)育機(jī)制，闡明基因功能，篩選藥物，遺傳性疾病的基因治療等方面具有廣闊的前景。為使hESCs能夠應(yīng)用于各種疾病的臨床治療，學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了大量研究并取得一定進(jìn)展，如維持hESCs全能性、無(wú)限增殖及自我更新相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)，體外誘導(dǎo)hESCs分化為胰島細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、造血細(xì)胞、心肌細(xì)胞等培養(yǎng)模式的初步建立等。另外，hESCs在遺傳性疾病治療方面具有重要的研究前景，建立攜

3、帶遺傳性疾病基因的人胚胎干細(xì)胞系是進(jìn)行發(fā)育早期遺傳性疾病的發(fā)病機(jī)理、遺傳疾病基因定位及基因治療等研究的基礎(chǔ)。
　　 多囊卵巢綜合征（polycysticovarysyndrome，PCOS）是育齡婦女最常見(jiàn)的復(fù)雜的內(nèi)分泌失調(diào)性疾病，迄今為止，發(fā)病機(jī)制尚不清楚，無(wú)有效的治療措施。目前認(rèn)為其病變可能起始于胚胎期，家族聚集現(xiàn)象提示可能與遺傳因素有關(guān)。國(guó)內(nèi)外已利用胚胎植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)（preimplantationgeneticdi

4、agnosis，PGD）或核移植技術(shù)建立攜帶有先天性或者“轉(zhuǎn)基因”的遺傳性ES細(xì)胞系，但尚無(wú)關(guān)于PCOS源性人胚胎干細(xì)胞建系的報(bào)道。
　　 第一部分：
　　 1本實(shí)驗(yàn)利用本中心PCOS患者體外受精-胚胎移植（invitrofertilization-embryotransfer，IVF-ET）周期中，不適合移植和冷凍的新鮮廢棄胚胎，或廢棄的冷凍胚胎建立PCOS源性人胚胎干細(xì)胞系，為研究PCOS患者的19枚冷凍胚胎，解凍后

5、存活14枚胚胎，復(fù)蘇率為73.7％，序貫培養(yǎng)后形成6枚囊胚，囊胚形成率為42.9％，優(yōu)質(zhì)囊胚2枚，優(yōu)質(zhì)囊胚率為33.3％，A級(jí)ICM有1枚，B級(jí)ICM有1枚，C級(jí)ICM有4枚。機(jī)械分離法獲得5枚ICM。
　　 2.PCOS源性hESCs的建立共接種16枚ICM到混合飼養(yǎng)層上，48h內(nèi)貼壁13個(gè)，貼壁率為81.3％，貼壁的ICM均能長(zhǎng)出原代克隆。利用新鮮廢棄胚胎共建立5株P(guān)COS源性的人胚胎干細(xì)胞系，分別命名為p-hES-1，p-

6、hES-2，p-hES-3，p-hES-4，p-hFS-5。p-hES-1傳至36代后將所有細(xì)胞采用玻璃化冷凍方法凍存，目前p-hES-2傳至32代，p-hES-3傳至28代，p-hES-4傳至25代，p-hES-5傳至19代，仍在體外繼續(xù)培養(yǎng)。解凍胚胎來(lái)源的克隆目前有5個(gè)，傳至3-4代，繼續(xù)培養(yǎng)中。
　　 3.PCOS源性hESCs的鑒定結(jié)果3.1倒置顯微鏡下觀察，hESCs呈鳥巢狀，細(xì)胞界限清楚。
　　 3.25株h

7、ESCs細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性較強(qiáng)，克隆染成紫藍(lán)色；免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞表面抗原SSEA-4表達(dá)呈陽(yáng)性。
　　 3.35株hESCs細(xì)胞內(nèi)均表達(dá)OCT-4。
　　 3.45株hESCs體外懸滴培養(yǎng)后可自發(fā)分化形成擬胚體。
　　 3.55株hESCs的細(xì)胞懸液注射入SCID小鼠體內(nèi)可形成畸胎瘤，HE染色切片可見(jiàn)腺體、肌肉組織、脂肪細(xì)胞、骨組織等結(jié)構(gòu)。
　　 3.65株hESCs核型均正常，分別為46，XY：46

8、，XX；46，XX；46，XY；46，XX。
　　 結(jié)論：
　　 1.新鮮廢棄胚胎有不同程度的發(fā)育潛能，若能合理利用新鮮廢棄胚胎，以及已成功妊娠、順利分娩患者的廢棄冷凍胚胎，可有效地緩解hESCs建系過(guò)程中胚胎缺乏的問(wèn)題，并減少其中的倫理學(xué)紛爭(zhēng)。
　　 2.本研究首次報(bào)道了5株P(guān)COS源性人胚胎干細(xì)胞系的建立，均符合目前hESCs的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，能夠在體內(nèi)、體外向三個(gè)胚層細(xì)胞分化。
　　 3.PCOS源性人胚

9、胎干細(xì)胞系的建立可為研究PCOS的發(fā)病機(jī)理、篩選候選基因、基因定位及基因治療等方面提供了一個(gè)良好的生物學(xué)模型。
　　 第二部分：
　　 1內(nèi)細(xì)胞團(tuán)位PCOS患者的19枚冷凍胚胎，解凍后存活14枚胚胎，復(fù)蘇率為73.7％，序貫培養(yǎng)后形成6枚囊胚，囊胚形成率為42.9％，優(yōu)質(zhì)囊胚2枚，優(yōu)質(zhì)囊胚率為33.3％，A級(jí)ICM有1枚，B級(jí)ICM有1枚，C級(jí)ICM有4枚。機(jī)械分離法獲得5枚ICM。
　　 2.PCOS源性hES

10、Cs的建立共接種16枚ICM到混合飼養(yǎng)層上，48h內(nèi)貼壁13個(gè)，貼壁率為81.3％，貼壁的ICM均能長(zhǎng)出原代克隆。利用新鮮廢棄胚胎共建立5株P(guān)COS源性的人胚胎干細(xì)胞系，分別命名為p-hES-1，p-hES-2，p-hES-3，p-hES-4，p-hES-5。p-hES-1傳至36代后將所有細(xì)胞采用玻璃化冷凍方法凍存，目前p-hES-2傳至32代，p-hES-3傳至28代，p-hES-4傳至25代，p-hES-5傳至19代，仍在體外繼續(xù)

11、培養(yǎng)。解凍胚胎來(lái)源的克隆目前有5個(gè)，傳至3-4代，繼續(xù)培養(yǎng)中。
　　 3.PCOS源性hESCs的鑒定結(jié)果3.1倒置顯微鏡下觀察，hESCs呈鳥巢狀，細(xì)胞界限清楚。
　　 3.25株hESCs細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性較強(qiáng)，克隆染成紫藍(lán)色；免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞表面抗原SSEA-4表達(dá)呈陽(yáng)性。
　　 3.35株hESCs細(xì)胞內(nèi)均表達(dá)OCT-4。
　　 3.45株hESCs體外懸滴培養(yǎng)后可自發(fā)分化形成擬胚體。

12、　　 3.55株hESCs的細(xì)胞懸液注射入SCID小鼠體內(nèi)可形成畸胎瘤，HE染色切片可見(jiàn)腺體、肌肉組織、脂肪細(xì)胞、骨組織等結(jié)構(gòu)。
　　 3.65株hESCs核型均正常，分別為46，XY；46，XX；46，XX；46，XY；46，XX。
　　 結(jié)論：
　　 1.新鮮廢棄胚胎有不同程度的發(fā)育潛能，若能合理利用新鮮廢棄胚胎，以及已成功妊娠、順利分娩患者的廢棄冷凍胚胎，可有效地緩解hESCs建系過(guò)程中胚胎缺乏的問(wèn)題，并