膀胱癌的分子細胞遺傳學(xué)研究.pdf

1、【目的】膀胱移行細胞癌是中國主要惡性腫瘤之一,其發(fā)生發(fā)展與癌基因的過度表達和/或抑癌基因的失活有關(guān).分子生物學(xué)研究已取得一系列較重要的進展,然而至今還沒有找到特異的分子改變.腫瘤組織的不易培養(yǎng)使得從細胞遺傳學(xué)角度分析染色體改變較為困難.該研究應(yīng)用比較基因組雜交和多色熒光原位雜交技術(shù)從整個基因組水平考察26例膀胱移行細胞癌組織標(biāo)本和膀胱癌細胞系BIU87的染色體改變,繼而進一步分析染色體改變具體區(qū)域,鑒定該病非隨機性的染色體DNA擴增和缺

2、失,為闡明膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ)提供資料,為膀胱癌的預(yù)防、診斷以及治療提供有益的線索.【方法】用缺口平移法或DOP-PCR法,以生物素-16-dUTP標(biāo)記腫瘤DNA,以地高辛-11-dUTP標(biāo)記作為對照的胎盤DNA,將腫瘤及對照DNA探針混合,與Cot-1 DNA一起沉淀;全染色體涂染探針用PCR法,以生物素-16-dUTP、地高辛-11-dUTP分別分批標(biāo)記.制備雜交液變性后與中期染色體在37℃雜交48~72小時.雜交完畢,標(biāo)記生物

3、素的DNA探針用抗生物素蛋白-異硫氰酸熒光素(avidin-FITC)、羊抗生物素蛋白抗體(BAA)和第二層抗生物素蛋白-FITC檢測;標(biāo)記地高辛的DNA探針用鼠源抗地高辛抗體(anti-Dig)、兔抗鼠抗體-羅丹明(TRITC)和羊抗兔抗體-TRITC檢測.用連在熒光顯微鏡上的冷電荷藕合設(shè)備相機獲取三種熒光的灰圖,灰圖經(jīng)Metamorph 圖像系統(tǒng)處理分別被賦予藍、綠、紅三色.用CGH analyzer軟件確定每條染色體的中軸,再計算

4、中軸上FITC和TRITC兩種熒光的強度并計算兩者的比值.比值低于0.8有DNA拷貝數(shù)降低,大于1.2有DNA拷貝數(shù)增加.M-FISH根據(jù)Metamorph圖像系統(tǒng)獲得的圖像直接分析染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的異常.【結(jié)果】26例膀胱移行細胞癌均有DNA拷貝數(shù)的變化.拷貝數(shù)增加的頻率高于拷貝數(shù)減少的頻率,平均每個患者有7.3處發(fā)生擴增和4.3處缺失.DNA拷貝數(shù)增加多發(fā)生于染色體19q(12/26)、1p(11/26)、20q(10/26)、5p

5、(9/26)、17q(9/26)、3p(8/26)、16q(8/26)、21q(8/26)、3q(7/26)、8q(7/26)、9q(7/26)、11q(7/26);3p、5p、3q和17q在一些病例中可見DNA的高度擴增.DNA拷貝數(shù)減少多發(fā)生于9q (10/26)、9p (9/26)、17p(6/26)、18q(6/26)和19p(6/26),DNA拷貝數(shù)減少發(fā)生的位點和頻率均低于既往的報導(dǎo).M-FISH分析膀胱癌細胞系BIU87,