瘦素對帕金森病神經(jīng)損傷的保護(hù)和機(jī)制初探.pdf

1、帕金森病(Parkinson’s diseases, PD)的病理變化為中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元變性、死亡、缺失,黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能系統(tǒng)功能減退,并在殘存神經(jīng)元呈現(xiàn)α-突觸核蛋白(α-synuclein)和泛素染色陽性的胞漿包涵體體形成。因此尋找有效的神經(jīng)保護(hù)因子,對帕金森病的發(fā)病進(jìn)程進(jìn)行干預(yù),進(jìn)而減輕神經(jīng)損傷、恢復(fù)神經(jīng)功能,這是目前研究關(guān)注的熱點。
　　瘦素(Leptin)作為一種能量代謝調(diào)節(jié)因子,在炎癥反應(yīng)和創(chuàng)傷修復(fù)方面也具

2、有重要功能。最近有關(guān)其神經(jīng)保護(hù)作用的研究越來越多,但對其作用機(jī)制的研究還知之甚少,尤其是在帕金森病的研究領(lǐng)域。為了解瘦素在帕金森病中的作用及其病理生理機(jī)制,本研究擬通過帕金森病患者的血樣分析,探討瘦素對帕金森病的關(guān)聯(lián)性,并建立6-OHDA誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠的帕金森動物模型,6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)和魚藤酮( Rotenone)誘導(dǎo)多巴胺能樣細(xì)胞系SH-SY5Y細(xì)胞的帕金森病細(xì)胞模型來探討瘦

3、素對帕金森病神經(jīng)損傷的保護(hù)以及機(jī)制。
　　本課題包括以下三個部分工作:
　　第一部分帕金森病患者血清瘦素及其受體,以及氧化應(yīng)激的變化
　　目的:探討血清中的leptin和可溶性瘦素受體(Soluble leptin receptor, sObR)水平,以及氧化和抗氧化指標(biāo)與帕金森病的關(guān)系性;方法:1.檢測健康人群(年齡范圍平均)人的leptin和sObR水平;2.檢測PD患者和對照組(主要老年群體)中的leptin和s

4、ObR水平,檢測兩個群體中的丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)和還原型谷胱甘肽(Glutathione, GSH)的水平;3.分析leptin和sObR水平與帕金森病的相關(guān)性,以及與年齡的相關(guān)性,與男女性別的相關(guān)性;4.分析MDA、GSH以及SOD的水平與帕金森的相關(guān)性,以及和leptin與sObR的相關(guān)性。結(jié)果:1.隨著年齡的增加,leptin的水平

5、有所增加但是在40歲左右穩(wěn)定,sObR變化不大;2.帕金森病患者相對于對照組(老年群體), MDA和sObR水平有所增加,但leptin、SOD和GSH水平有所下降(P<0.05);3.女性的leptin水平高于男性,sObR水平低于男性(P<0.05);4. GSH和SOD與leptin水平呈正相關(guān),與sObR呈負(fù)相關(guān);MDA與leptin水平呈負(fù)相關(guān),與sObR呈正相關(guān)。結(jié)論:1.帕金森患者中,血清中氧化應(yīng)激水平高,leptin水平

6、低,sObR水平高;2.保持較高的血清leptin水平,有降低患帕金森病風(fēng)險的可能性。
　　第二部分瘦素對帕金森病動物模型黑質(zhì)區(qū)域的保護(hù)
　　目的:在建立的PD動物模型基礎(chǔ)上,觀察leptin對于黑質(zhì)區(qū)域損傷的保護(hù),以及下游氧化應(yīng)激水平的變化。方法:①建立6-OHDA誘導(dǎo)的右側(cè)損傷的 PD動物模型,假手術(shù)組(對照組),模型組,模型+leptin組,模型+leptin+nanobody組,通過皮下注射阿撲嗎啡,通過向左側(cè)旋轉(zhuǎn)次

7、數(shù)鑒定動物模型是否建立成功;②免疫組化檢測各組中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元特異性蛋白酪氨酸羥化酶的變化;③收集各組血清,檢測MDA、GSH和SOD的變化。結(jié)果:1.阿撲嗎啡皮下注射后,模型組相對于對照組,左側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)顯著增加,模型+leptin組旋轉(zhuǎn)次數(shù)減少,加入nanobody后,旋轉(zhuǎn)次數(shù)右顯著增加;2.模型組及模型+leptin+nanobody組右側(cè)黑質(zhì)區(qū)域多巴胺能相對于左側(cè)明顯減少,模型+leptin組右側(cè)黑質(zhì)區(qū)域多巴胺能相對于左側(cè)

8、有所減少,但較模型組和加入 nanobody組有所增加。3.各組血清中,模型組相對于對照組MDA有所增加,GSH和SOD有所減少,模型+leptin組相對于模型組和 leptin+nanobody組,MDA有所減少,GSH和 SOD有所增加。結(jié)論:1.外源性Leptin能夠減少PD的嚴(yán)重程度,能夠減少多巴胺能神經(jīng)元的丟失;2. Leptin在PD動物模型中,可顯著降低血清中MDA水平,升高SOD和GSH水平,在阻斷脂質(zhì)過氧化,增加抗氧化

9、性,維持機(jī)體氧化平衡的穩(wěn)定具有積極作用。
　　第三部分瘦素減輕6-羥基多巴胺和魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的機(jī)制研究
　　目的:通過6-OHDA和rotenone誘導(dǎo)SH-SY5Y的帕金森病細(xì)胞模型,對leptin的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制進(jìn)行探討。方法:6-OHDA和rotenone去誘導(dǎo)SH-SY5Y。①CCK-8和LDH分別檢測不同濃度6-OHDA和rotenone誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的存活率和損傷率;②CCK-8、

10、LDH、臺盼藍(lán)和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測 leptin對于100μmol/L6-OHDA和5μmol/Lrotenone誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的存活、損傷、死亡以及凋亡的影響,以及其受體阻斷劑 nanobody的影響。③熒光探針檢測,leptin對于6-OHDA和rotenone損傷導(dǎo)致ATP和ROS變化的影響,以及,免疫熒光和Western blot檢測和cleaved caspase-3的變化。④Nanobody加入后,檢測相關(guān)細(xì)胞裂解液

11、中的SOD、MDA和GSH這些氧化性和抗氧化性指標(biāo)的變化。⑤CCK-8檢測,AG490、nanobody、LY294002、compound C、U0126、ZnPP,對于leptin對于6-OHDA和rotenone損傷減輕的影響,并比較LiCl和CoPP對細(xì)胞的保護(hù)。⑥Leptin模型保護(hù)加入LY294002、compound C和U0126后,Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax,以及相關(guān)通路分子p-Akt,

12、p-ERK1/2,p-AMPK,p-GSK3β,HO-1,Western blot及RT-PCR檢測帕金森相關(guān)蛋白,RT-PCR檢測α-synuclein的mRNA水平。Western blot檢測LiCl和CoPP對于模型組Bcl-2、Bax以及HO-1的表達(dá)影響。結(jié)果:1. Leptin提高了SH-SY5Y細(xì)胞的存活率,降低了損傷率及凋亡率;2.相應(yīng)的阻斷劑加入后, leptin的保護(hù)作用均有所減弱;3. Leptin提高了ATP的

13、增加,降低了ROS的水平。4. Nanobody加入,逆轉(zhuǎn)了leptin引起的MDA的降低,SOD和GSH的升高;5. Leptin提高了Bcl-2和HO-1的表達(dá),降低了cleaved caspase-3、Bax和α-synuclein的表達(dá),并且提高了 p-Akt、p-ERK1/2、p-AMPK以及 p-GSK3β的水平,阻斷劑的加入部分逆轉(zhuǎn)了leptin的影響,相應(yīng)蛋白的阻斷劑都降低了p-GSK3β的水平,并降低了leptin提高