條件培養(yǎng)液對(duì)血管平滑機(jī)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制探討.pdf

1、血管重塑性疾病發(fā)生發(fā)展的病理生理機(jī)制是目前心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一,而血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)過(guò)度增殖在高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄等血管重塑性疾病形成與發(fā)展中起著重要作用,并且隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)在再狹窄(rcstcnosis,RS)等血管重塑性疾病中存在著細(xì)胞凋亡的變化,VSMC增殖與凋亡的動(dòng)態(tài)平衡決定了血管壁細(xì)胞數(shù)量和新生內(nèi)膜的增生程度。
　　 目的

2、：
　　 細(xì)胞增殖是通過(guò)細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)的,是外界的增殖刺激信號(hào)如胰島素樣生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、上皮生長(zhǎng)因子等通過(guò)其細(xì)胞膜或胞內(nèi)受體作用,經(jīng)過(guò)跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo),將細(xì)胞外信號(hào)傳遞到核內(nèi),啟動(dòng)增殖相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄,最終作用于細(xì)胞周期,從而使VSMC發(fā)生過(guò)度增殖?？梢?jiàn)發(fā)出外界增殖刺激信號(hào)是決定細(xì)胞增殖與否的始動(dòng)因素,既往國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究多關(guān)注內(nèi)皮細(xì)胞損傷引致炎癥反應(yīng)而激活一系列細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、血管活性物

3、質(zhì)等增殖刺激信號(hào)進(jìn)一步引起細(xì)胞增殖,而在上述血管重塑性疾病中,尤其在RS中,由于缺血缺氧及血管成形術(shù)本身的機(jī)械損傷,受損的VSMC是否能夠同樣誘發(fā)產(chǎn)生增殖刺激信號(hào)而作用于其周圍正常的VSMC,使其發(fā)生表型轉(zhuǎn)化,生物學(xué)行為發(fā)生改變,獲得異常增殖的能力尚無(wú)報(bào)道,本研究通過(guò)模擬體內(nèi)缺血缺氧環(huán)境,而在體外構(gòu)建了VSMC的氧糖剝奪模型,并制成其條件培養(yǎng)液,作用于正常的VSMC,來(lái)觀察其對(duì)周圍正常的VSMC增殖、凋亡和遷移等生物學(xué)行為的影響,并初步

4、探討其作用機(jī)制,從而不僅為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)血管重塑性疾病的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),而且可能為該類疾病的有效防治提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、氧糖剝奪血管平滑肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液制備條件優(yōu)化
　　 分為6組:對(duì)照組;10％血清+低糖低氧;5％血清+低糖低氧;無(wú)血清+高糖低氧;無(wú)血清+低糖低氧:無(wú)血清+無(wú)糖低氧,按分組要求分別配制培養(yǎng)基,用前通入5％CO2、10％H2、85％N2混合氣體飽和15 min,即制成

5、低氧溶液。高糖培養(yǎng)基含糖量為25 mmol/L,低糖培養(yǎng)基含糖量為5.5 mmol/L。將此溶液加入培養(yǎng)板中,然后置于厭氧培養(yǎng)箱(內(nèi)含5％CO2、10％H2、85％N2混合氣體)培養(yǎng),對(duì)照組用含10％血清低糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、飽和濕度、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。各組分別培養(yǎng)24h、48h、72h,3000 rpm離心10min,取培養(yǎng)上清液。采用MTT法和臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活力和增殖情況。按上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定氧糖剝奪條件,并按此

6、條件制備氧糖剝奪VSMC條件培養(yǎng)液(簡(jiǎn)稱條件培養(yǎng)液)。
　　 2、實(shí)驗(yàn)分組
　　 實(shí)驗(yàn)分為兩組,每組采用3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組:無(wú)血清培養(yǎng)基組;處理組:條件培養(yǎng)液處理組。培養(yǎng)VSMC細(xì)胞,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)前吸棄培養(yǎng)基上清,用PBS清洗3次后分別加入等量的無(wú)血清培養(yǎng)基為對(duì)照組,加入條件培養(yǎng)液作為處理組,分別在37℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24、48、72小時(shí)。
　　 3、條件培養(yǎng)液對(duì)VSMC增殖的

7、影響
　　 微量培養(yǎng)四唑鹽測(cè)定法[microculmre tetrazolium assay,MTT]檢測(cè)經(jīng)條件培養(yǎng)液處理后,VSMC的增殖能力變化;流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測(cè)條件培養(yǎng)液對(duì)VSMC細(xì)胞周期的影響;實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(real time-reversal transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、Western blot方法檢

8、測(cè)VSMC細(xì)胞內(nèi)CyclinDl的表達(dá)水平;酶聯(lián)免疫吸附分析(enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)方法檢測(cè)條件培養(yǎng)液中白細(xì)胞介素-1(imerleukin-1,IL-1)含量及MTr法檢測(cè)IL-1對(duì)VSMC細(xì)胞增殖的影響。
　　 4、條件培養(yǎng)液對(duì)VSMC凋亡的影響
　　 Hoechst染色法進(jìn)行VSMC凋亡情況的激光共聚焦檢測(cè);ELISA方法檢測(cè)VSMC內(nèi)caspase-3和ca

9、spase-9的活性水平,RT PCR、Western blot方法檢測(cè)VSMC內(nèi)Bcl-2、PARP、cleaved-PARP的表達(dá)量。
　　 5、條件培養(yǎng)液對(duì)VSMC遷移能力的影響
　　 Transwell法檢測(cè)條件培養(yǎng)液對(duì)VSMC遷移能力影響;RT PCR、Western blot方法檢測(cè)經(jīng)條件培養(yǎng)液處理后VSMC內(nèi)MMP-2和MMP-9的mRNA水平和蛋白水平;ELISA方法檢測(cè)VSMC對(duì)MMP-2和MMP-9分

10、泌表達(dá)情況。
　　 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以-x±SD表示,兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn),多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析,多重比較采用LSD及Ounnett's T3檢驗(yàn)。以P＜0.05作為差異有顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 1、無(wú)血清無(wú)糖低氧條件下VSMC損傷最為嚴(yán)重,并且隨處理時(shí)間延長(zhǎng),損傷進(jìn)一步加劇。無(wú)血清無(wú)糖低氧條件下處理24、48、72 h,臺(tái)

11、盼藍(lán)檢測(cè)結(jié)果:VSMC存活率分別為67.88％、49.72％、28.02％,與處理前比較細(xì)胞死亡率為29.56％、40.00％和59.33％。MTT檢測(cè)結(jié)果:VSMC存活率分別為68.23％、46.57％、24.08％,與處理前比較細(xì)胞死亡率為30.26％、42.44％和63.84％。光鏡下觀察無(wú)血清無(wú)糖低氧條件下處理的VSMC,可見(jiàn)細(xì)胞腫脹、變圓,出現(xiàn)壞死情況,并且,隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),VSMC壞死加劇。故選擇無(wú)血清無(wú)糖低氧處理72h

12、作為VSMC的氧糖剝奪條件培養(yǎng)液制各條件。
　　 2、氧糖剝奪VSMC條件培養(yǎng)液對(duì)VSMC增殖的影響:MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示,經(jīng)條件培養(yǎng)液培養(yǎng)VSMC24h、48h、72h后,細(xì)胞吸光度值分別為對(duì)照組的1.43倍、1.63倍和1.71倍,尤其在培養(yǎng)48、72h與對(duì)照組相比差異具有顯著性(P＜0.05),并且隨著條件培養(yǎng)液處理時(shí)間的延長(zhǎng),VSMC的增殖能力增加明顯(P＜0.05);FCM細(xì)胞周期分析顯示:條件培養(yǎng)液處理組細(xì)胞周期有所

13、改變,G0/G1期所占比例降低,而S期和G2/M期所占比例增加,尤其G2/M期增加明顯。對(duì)照組細(xì)胞周期無(wú)明顯變化。表明氧糖剝奪VSMC條件培養(yǎng)液可促進(jìn)細(xì)胞周期由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換及由S期向G2/M期轉(zhuǎn)換的進(jìn)程,從而促進(jìn)VSMC增殖;RT-PCR及Western Blot結(jié)果分別提示條件培養(yǎng)液處理組CyelinD1在mRNA及蛋白水平表達(dá)較對(duì)照組有所提高。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示:經(jīng)氧糖剝奪處理的VSMC,釋放的IL-1水平顯著增加(P

14、＜0.01),同時(shí)經(jīng)MTT檢測(cè)IL-1組和條件培養(yǎng)液組分別培養(yǎng)VSMC24 h、48 h和72 h后,VSMC細(xì)胞吸光度值分別為0.126、0.175、0.249和0.083、0.142、0.245,均高于對(duì)照組的0.067、0.072、0.149,表明IL-1和條件培養(yǎng)液均可促進(jìn)VSMC的增殖:在條件培養(yǎng)液中加入IL-1拮抗劑后,條件培養(yǎng)液對(duì)VSMC增殖的促進(jìn)作用有所下降,細(xì)胞吸光度值分別為0.082、0.112、0.138,與對(duì)照組

15、相近,進(jìn)一步說(shuō)明條件培養(yǎng)液中IL-1可以促進(jìn)VSMC細(xì)胞增殖。
　　 3、氧糖剝奪VSMC條件培養(yǎng)液對(duì)VSMC凋亡的影響:ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示VSMC經(jīng)條件培養(yǎng)液處理48、72 h后,VSMC中促凋亡指標(biāo)Caspase-3和Caspase-9的吸光度比值均較對(duì)照組降低(P＜0.05);RT-PCR結(jié)果提示:與對(duì)照組相比,條件培養(yǎng)液使抑制凋亡的指標(biāo)Bcl-2mRNA表達(dá)增加,對(duì)凋亡時(shí)Caspase家族的剪切底物PARP蛋白其上

16、游的PARPmRNA表達(dá)無(wú)影響。Western blot結(jié)果提示:與對(duì)照組相比,條件培養(yǎng)液使Bcl-2蛋白表達(dá)增加,使凋亡時(shí)Caspase家族剪切PARP蛋白后的產(chǎn)物cleaved-PARP蛋白的表達(dá)降低,說(shuō)明條件培養(yǎng)液對(duì)凋亡有抑制作用,同時(shí)提示條件培養(yǎng)液對(duì)PARP的調(diào)控不是在mRNA水平上,而是在蛋白水平上。
　　 4、氧糖剝奪VSMC條件培養(yǎng)液對(duì)VSMC遷移能力的影響:Transwell法測(cè)定與對(duì)照組比較,條件培養(yǎng)液處理組V

17、SMC48、72小時(shí)遷移細(xì)胞數(shù)明顯增多(P＜0.05)。RT-PCR及Western blot結(jié)果分別提示在孵育48及72小時(shí),處理組VSMC內(nèi)MMP-2和MMP-9在mRNA水平和蛋白水平均較對(duì)照組明顯提高。同時(shí),ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示:處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2和MMP-9的分泌量也較對(duì)照組增加。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功建立VSMC氧糖剝奪模型,制備VSMC氧糖剝奪條件培養(yǎng)液。
　　 2、VSMC

18、氧糖剝奪條件培養(yǎng)液能夠促進(jìn)VSMC的增殖,此作用可能通過(guò)上調(diào)VSMC中CyclinD1的表達(dá),促進(jìn)VSMC細(xì)胞周期由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換及由S期向G2/M期的轉(zhuǎn)換,從而促進(jìn)VSMC的增殖。
　　 3、氧糖剝奪條件培養(yǎng)液可能通過(guò)上調(diào)Bcl-2 tuRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)、下調(diào)cleaved-PARP的表達(dá)和Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡。
　　 4、氧糖剝奪條件培養(yǎng)液可能通過(guò)上調(diào)MMP-2和MMP