富氫鹽水通過(guò)失活RaS-ERK1-2-MEK1-2和Akt通路及抑制ROS減輕血管平滑肌細(xì)胞的增殖及大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后新生內(nèi)膜的增生.pdf

1、冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)對(duì)于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病具有劃時(shí)代的意義。但是，即便是應(yīng)用了藥物洗脫支架，仍有5-10％的再狹窄率。
　　 血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)在血管損傷因素刺激下進(jìn)行增殖和遷移，是動(dòng)脈粥樣硬化和血管再狹窄等血管重塑性疾病的細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)。
　　 活性氧(ROS)和氧化應(yīng)激涉及到動(dòng)脈粥樣硬化和再狹窄的病理生理過(guò)程，氫氣是一種潛在的抗氧化劑，能清除

2、中和自由基(如·OH和ONOO-)，大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)氫氣是一個(gè)清道夫，選擇性地中和ROS并行使著潛在的細(xì)胞保護(hù)功能。至關(guān)重要的是到目前為止氫氣行使這些效能的確切機(jī)制還不十分明了。除了其抗氧化效能，有一些特殊通路可能參與其作用機(jī)制。
　　 為了闡明富氫介質(zhì)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移作用及其分子機(jī)制，本文在系統(tǒng)研究富氫介質(zhì)對(duì)VSMC增殖、遷移、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討其對(duì)涉及血管平滑肌細(xì)胞增殖遷

3、移通路的影響，另外在大體上，制作大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷的模型來(lái)模擬PTCA的過(guò)程，觀察富氫鹽水對(duì)新生內(nèi)膜增殖的影響并探討可能的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1、富氫介質(zhì)通過(guò)失活Ras-ERK1/2-MEK1/2和Akt通路及抑制ROS減輕血管平滑肌細(xì)胞的的增殖
　　 本部分實(shí)驗(yàn)在系統(tǒng)研究富氫介質(zhì)對(duì)VSMC增殖、遷移、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討其對(duì)涉及血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移通路的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:<

4、br>　　 1.1、氫氣對(duì)VSMC增殖活力的影響
　　 我們完成MTT實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估氫氣對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖活性的抑制效果，結(jié)果顯示，氫氣干預(yù)組平滑肌細(xì)胞的增殖活性比對(duì)照組明顯下降(32.4±5.2％vs73.3±5.1％,p＜0.01)。
　　 為了評(píng)估氫氣對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖活性的影響是否具有可逆性，氫氣干預(yù)組培養(yǎng)48小時(shí)后去除氫氣繼續(xù)培養(yǎng)至96小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束后再檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性，結(jié)果顯示，氫氣對(duì)細(xì)胞增殖活性的抑制是可逆

5、的，去除氫氣后，血管平滑肌細(xì)胞的增殖活性又恢復(fù)，這些結(jié)果顯示氫氣行使對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖活性的抑制作用不具有細(xì)胞毒性作用。
　　 氫氣對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖活性的作用也用BrdU實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，沒有氫氣干預(yù)的平滑肌細(xì)胞的BrdU值是(64.1±11.1)％，經(jīng)氫氣干預(yù)后，BrdU值是(26.7±4.9)％，顯示氫氣明顯抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖活性，并有明顯的時(shí)效性。
　　 氫氣對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的抑制效果進(jìn)一步被細(xì)胞計(jì)數(shù)

6、所證實(shí)，結(jié)果顯示在48h和72h和對(duì)照組(僅用FBS處理的血管平滑肌細(xì)胞)相比，用富氫介質(zhì)孵育的細(xì)胞數(shù)分別有40％和51％的下降。(P＜0.01)。
　　 1.2、富氫介質(zhì)對(duì)VSMC遷移活性的影響
　　 富氫介質(zhì)對(duì)FBS誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的遷移活性的抑制效果用傷口愈合實(shí)驗(yàn)證實(shí)，結(jié)果顯示，用FBS處理24h后的增加的遷移血管平滑肌細(xì)胞數(shù)為(58.3±13.9)，而同時(shí)用富氫介質(zhì)干預(yù)后，其遷移細(xì)胞顯著下降(18.6±5.8

7、),P＜0.01。
　　 1.3、富氫介質(zhì)阻止細(xì)胞周期進(jìn)入S期
　　 富氫介質(zhì)對(duì)細(xì)胞周期的影響用流式細(xì)胞儀測(cè)定。通過(guò)24h血清饑餓法使細(xì)胞處于靜止期，78.6±1.4％的細(xì)胞處于G0/G1期，10.4±0.2％處于S期，通過(guò)10％FBS的誘導(dǎo)使靜止的血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)入S期，處于G0/G1期的細(xì)胞顯著降低(51.9±0.9)％，用富氫介質(zhì)處理后顯示抑制了由FBS所誘導(dǎo)的G1-S的進(jìn)入，結(jié)果顯示處于G0/G1期的細(xì)胞為(68

8、.8±2.2)％，而處于S期的細(xì)胞為(16.7±2.0)％，這些結(jié)果顯示富氫介質(zhì)阻止細(xì)胞周期進(jìn)入S期。
　　 1.4、富氫介質(zhì)的抗增殖效果是通過(guò)抑制Ras-MEK1/2-ERK1/2通路而實(shí)現(xiàn)的
　　 為了研究富氫介質(zhì)抗增殖效果的機(jī)制，用蛋白印跡分析Ras的活性，結(jié)果顯示，10％FBS誘導(dǎo)Ras快速地激活，用富氫介質(zhì)處理后顯示其可以輕微抑制由FBS誘導(dǎo)的Ras的激活。
　　 磷酸化的MEK1/2和ERK1/2是R

9、as的下游激酶，在本實(shí)驗(yàn)中也被研究，結(jié)果顯示，富氫介質(zhì)顯著地降低由FBS所誘導(dǎo)的磷酸化MEK1/2的活性;數(shù)據(jù)也顯示FBS也可以誘導(dǎo)磷酸化ERK1/2的激活，在應(yīng)用富氫介質(zhì)干預(yù)后，顯著抑制磷酸化ERK1/2的激活，相對(duì)的，總的ERK1/2蛋白水平在應(yīng)用富氫介質(zhì)干預(yù)后沒有明顯的變化。
　　 1.5、富氫介質(zhì)對(duì)磷酸化Akt的影響
　　 研究顯示P13k-Akt通路介導(dǎo)了由FBS誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，富氫介質(zhì)對(duì)這個(gè)

10、通路的影響在本實(shí)驗(yàn)中被調(diào)查，結(jié)果顯示，F(xiàn)BS顯著誘導(dǎo)Akt的激活，富氫介質(zhì)顯著地抑制由FBS所誘導(dǎo)的磷酸化的Akt的激活。
　　 1.6、富氫介質(zhì)對(duì)PCNA表達(dá)的影響
　　 研究顯示，F(xiàn)BS顯著誘導(dǎo)了PCNA的表達(dá)，而應(yīng)用了富氫介質(zhì)后其表達(dá)明顯受到抑制，說(shuō)明富氫介質(zhì)可以從核水平抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。
　　 1.7、富氫介質(zhì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的抑制效果
　　 細(xì)胞內(nèi)ROS通過(guò)流式細(xì)胞分析用DCHF

11、-DA測(cè)定，結(jié)果顯示，F(xiàn)BS顯著地誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，平均MFI水平是483.0±15.1，富氫介質(zhì)干預(yù)后，MFI水平是395.6±16.1，說(shuō)明富氫介質(zhì)顯著抑制由FBS誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生，P＜0.01。
　　 細(xì)胞內(nèi)8-OHDG的水平由ELISA方法測(cè)定，結(jié)果顯示，F(xiàn)BS顯著地誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)8-OHDG的產(chǎn)生，其所測(cè)數(shù)值是1.6±0.1ng/ml，富氫介質(zhì)干預(yù)后，所測(cè)數(shù)值是1.3±0.0ng/ml，說(shuō)明富氫介質(zhì)對(duì)FBS誘導(dǎo)的8

12、-OHDG的產(chǎn)生有明顯的抑制作用，P＜0.01。
　　 MDA是脂過(guò)氧化物的終末產(chǎn)物，結(jié)果顯示，F(xiàn)BS顯著地誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)MDA的產(chǎn)生，其所測(cè)數(shù)值是3.7±0.2ng/ml，富氫介質(zhì)干預(yù)后，所測(cè)數(shù)值是2.9±0.1ng/ml，說(shuō)明富氫介質(zhì)對(duì)FBS誘導(dǎo)的MDA的產(chǎn)生有明顯的抑制作用，P＜0.01。
　　 2、富氫鹽水通過(guò)失活Ras-ERK1/2-MEK1/2通路及抑制ROS減輕大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后新生內(nèi)膜的增殖效果
　　

13、 本部分實(shí)驗(yàn)在大體上，制作大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷的模型來(lái)模擬PTCA的過(guò)程，觀察富氫鹽水對(duì)新生內(nèi)膜增殖的影響并探討可能的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 2.1、富氫鹽水對(duì)大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后新生內(nèi)膜增殖的影響
　　 和對(duì)照組相比，球囊損傷后內(nèi)膜明顯地增生。不同劑量的富氫鹽水顯示了以劑量依賴的形式抑制新生內(nèi)膜的形成，和球囊損傷對(duì)照組相比，內(nèi)膜與中膜的比值(I/M)減少了36.9％(2.5ml/kg組)，52.2％(5ml/kg組

14、)and71.8％(10ml/kg組),P＜0.01。
　　 2.2、免疫組化分析富氫鹽水對(duì)新生內(nèi)膜中PCNA表達(dá)的影響
　　 PCNA陽(yáng)性的細(xì)胞在球囊損傷組是豐富的，但應(yīng)用了富氫鹽水的動(dòng)物標(biāo)本中經(jīng)免疫染色顯示PCNA陽(yáng)性的細(xì)胞明顯減少，Sham組IOD值是15.11±1.42;球囊損傷對(duì)照組是53.42±2.30;在2.5ml/kg富氫鹽水干預(yù)組其IOD值是45.25±1.62;5ml/kg組IOD是22.55±0.8

15、8;10ml/kg組IOD值是19.61±0.79。說(shuō)明富氫鹽水以劑量依賴的形式抑制了新生內(nèi)膜中的PCNA的表達(dá)。
　　 2.3、富氫鹽水通過(guò)抑制Ras-ERK1/2-MEK1/2通路抑制球囊損傷后新生內(nèi)膜的增生
　　 結(jié)果顯示，球囊損傷后新生內(nèi)膜明顯增生，相對(duì)應(yīng)的Ras、磷酸化ERK1/2、磷酸化MEK1/2激活，應(yīng)用富氫鹽水后，以劑量依賴的形式抑制這些蛋白的表達(dá)，說(shuō)明富氫鹽水通過(guò)抑制Ras-ERK1/2-MEK1/2

16、通路抑制球囊損傷后新生內(nèi)膜的增生。
　　 2.4、富氫鹽水對(duì)組織內(nèi)ROS的抑制效果
　　 結(jié)果顯示，球囊損傷后，頸動(dòng)脈內(nèi)膜組織內(nèi)的8-OHDG明顯增加，應(yīng)用富氫鹽水后，以劑量依賴的形式明顯降低了8-OHDG的水平;球囊損傷后，頸動(dòng)脈內(nèi)膜組織內(nèi)的MDA明顯增加，應(yīng)用富氫鹽水后，以劑量依賴的形式明顯降低了MDA的水平。說(shuō)明富氫鹽水通過(guò)抑制氧化應(yīng)激而起到抑制球囊損傷后新生內(nèi)膜的增殖。
　　 3、富氫介質(zhì)通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡

17、減輕血管平滑肌的增殖
　　 3.1、富氫介質(zhì)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響
　　 我們進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)富氫介質(zhì)誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的凋亡。結(jié)果顯示，對(duì)于早期凋亡，從1.36％(只用FBS處理)增加到2.1％(用FBS和富氫介質(zhì)共同處理)，P＜0.05;對(duì)于晚期凋亡，從6.96％(只用FBS處理)增加到13.47％(用FBS和富氫介質(zhì)共同處理)，P＜0.01;這些結(jié)果顯示富氫介質(zhì)誘導(dǎo)了血管平滑肌細(xì)胞的凋亡。
　　 3.2、富

18、氫介質(zhì)對(duì)Bax/Bcl2比值的影響
　　 為了進(jìn)一步證實(shí)富氫介質(zhì)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，用RT-PCR的方法測(cè)定了促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞凋亡的蛋白并計(jì)算二者的比值，結(jié)果顯示，用富氫介質(zhì)處理后，Bax/Bcl2比值顯著地增加(P＜0.01)，預(yù)示著富氫介質(zhì)能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　 3.3、細(xì)胞內(nèi)8-OHDG的水平由ELISA方法測(cè)定，結(jié)果顯示，F(xiàn)BS顯著地誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)8-OHDG的產(chǎn)生，其所測(cè)數(shù)值是1.6±0.1ng/ml，富氫介

19、質(zhì)干預(yù)后，所測(cè)數(shù)值是1.3±0.0ng/ml，說(shuō)明富氫介質(zhì)對(duì)FBS誘導(dǎo)的8-OHDG的產(chǎn)生有明顯的抑制作用，P＜0.01。
　　 3.4、MDA是脂過(guò)氧化物的終末產(chǎn)物，如結(jié)果顯示，F(xiàn)BS顯著地誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)MDA的產(chǎn)生，其所測(cè)數(shù)值是3.7±0.2ng/ml，富氫介質(zhì)干預(yù)后，所測(cè)數(shù)值是2.9±0.1ng/ml，說(shuō)明富氫介質(zhì)對(duì)FBS誘導(dǎo)的MDA的產(chǎn)生有明顯的抑制作用，P＜0.01。
　　 結(jié)論：
　　 1、富氫介質(zhì)可以有

20、效抑制VSMCs的增殖和遷移，其可能的機(jī)制包括
　　 1.1、阻止細(xì)胞周期從G0/G1期向S期進(jìn)展，此作用可能通過(guò)多種途徑實(shí)現(xiàn)，其中在核水平抑制PCNA的表達(dá)是其重要機(jī)制之一。
　　 1.2、富氫介質(zhì)通過(guò)抑制Ras-ERK1/2-MEK1/2通路抑制VSMCs的增和遷移
　　 1.3、富氫介質(zhì)顯著地抑制由FBS所誘導(dǎo)的磷酸化的Akt的激活。說(shuō)明其通過(guò)P13k/Akt通路影響著VSMCs的增殖和遷移
　　

21、1.4、通過(guò)抑制PCNA的表達(dá)，從核水平抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。
　　 1.5、富氫介質(zhì)可以顯著抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，通過(guò)抑制氧化應(yīng)激而發(fā)揮作用。
　　 2、富氫鹽水可以有效抑制大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后新生內(nèi)膜的增殖，其可能的機(jī)制包括
　　 2.1、富氫鹽水顯著抑制組織內(nèi)的ROS產(chǎn)生通過(guò)抑制氧化應(yīng)激而發(fā)揮作用。
　　 2.2、通過(guò)抑制PCNA的表達(dá)，在核水平抑制VSMCs的增殖和遷移