三苯氧胺治療乳腺癌分子作用機制研究.pdf

1、目的:研究三苯氧胺(TAM)是否對雌激素受體陰性的乳腺癌細胞具有生長抑制和誘導凋亡作用.觀察不同濃度三苯氧胺作用不同時間后,對ER陰性的MA782小鼠乳腺癌細胞細胞周期正負凋節(jié)因子細胞周期素D1(cyclin D1)、細胞周期素依賴性激酶4(cdk4)、細胞周期素依賴性激酶抑制因子(p21/WAF1/CIP1以下簡稱p21)、增殖細胞核抗原(PCNA)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)蛋白表達的影響.探討三苯氧胺誘導MA782細胞凋亡的分子

2、作用機制,揭示細胞周期正負調(diào)控因子在乳腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及乳腺癌治療方面所起的作用.對臨床內(nèi)分泌治療雌激素受體陰性的乳腺癌患者,提供新的啟示和實驗依據(jù).方法:(1)細胞培養(yǎng):常規(guī)培養(yǎng)MA782細胞,觀察細胞一般生物學特性.實驗分對照組(只加RPMI1640配養(yǎng)基,不加TAM)和 TAM誘導組(按不同濃度和不同作用時間點分組).(2)細胞增殖活性檢測(MTT法):用MTT法檢測對照組及各實驗組細胞增殖活性.(3)流式細胞儀檢測(FCM)

3、:收集對照組及各實驗組細胞標本,用流式細胞儀檢測細胞凋亡、細胞周期時相分布情況.(4)免疫細胞化學染色(ICC):用免疫細胞化學染色法(SABC法)鑒定MA782細胞雌激素受體及上述相應蛋白表達情況,并用病理圖像分析軟件進行半定量分析.(5)RT-PCR:用RT-PCR方法檢測cyclin D1mRNA,TGF-β1 mRNA表達變化.結(jié)果:(1)細胞培養(yǎng)結(jié)果顯示:MA782細胞具有腫瘤細胞的一般生物學特性,25ml培養(yǎng)瓶接種1.2×1

4、05個細胞,培養(yǎng)五天達到增殖高峰,第六天細胞生長開始出現(xiàn)接觸性抑制.(2)MTT檢測結(jié)果顯示:2 μmol/L TAM對細胞沒有明顯影響,6、10 μmol/L TAM則對細胞有不同程度的生長抑制作用,與對照組相比差異顯著(P<0.01),且與TAM濃度和作用時間呈正相關(guān).(3)FCM檢測結(jié)果顯示:2 μmol/L TAM作用于MA782細胞24小時后未出現(xiàn)凋亡峰,而6、10 μmol/L TAM作用24小時后則出現(xiàn)凋亡峰,細胞凋亡率分

5、別為7.04％、19.04％.10 μmol/L TAM作用48小時后細胞凋亡率從19.04％上升到51.27％.G0/G1期比例隨TAM濃度增加、作用時間延長從19.83％上升到98.69％.S期比例從80.17％下降到0％.說明三苯氧胺對MA782細胞有明顯的G0/G1期阻滯作用.(4)免疫細胞化學染色結(jié)果顯示:MA782細胞雌激素受體陰性.2 μmol/L TAM作用不同時間后,細胞無明顯上述蛋白變化,6、10μmol/LTAM作

6、用不同時間后,細胞cyclin D1、cdk4、PCNA蛋白表達均有不同程度的下降,與對照組相比差異顯著(P<0.05或P<0.01),而p21,TGF-β1蛋白表達則有不同程度的上升,與對照組相比亦差異顯著(P<0.05或P<0.01).(5)RT-PCR檢測結(jié)果顯示:2 μmol/LTAM組無明顯改變,而6、10 μmol/LTAM作用于細胞24、48小時后,細胞cyclin D1mRNA和TGF-β1mRNA表現(xiàn)出不同程度的變化,

7、與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01).結(jié)論:(1)TAM濃度大于2μmol/L時,對ER陰性的MA782小鼠乳腺癌細胞有明顯的生長抑制和誘導凋亡作用.(2)MA782細胞cyclin D1、cdk4、PCNA免疫組化染色均呈強陽性,p21、TGF-β 1亦呈陽性,表明上述指標均有不同程度的過表達現(xiàn)象,說明MA782細胞存在細胞周期紊亂.(3)TAM可下調(diào)MA782細胞cyclin D1、cdk4、PCNA蛋白表達,上調(diào)