水牛囊胚發(fā)育階段對(duì)原始態(tài)-始發(fā)態(tài)胚胎干細(xì)胞分離培養(yǎng)的影響.pdf

1、胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells，ESCs)的建系受其細(xì)胞來源以及培養(yǎng)環(huán)境等多種因素的影響，其中來自囊胚的ESCs受囊胚所處發(fā)育階段的影響最大。囊胚形成到囊胚植入子宮壁期間，其多能性細(xì)胞處于一種不斷自我更新和分化的過程，可能同時(shí)存在不同狀態(tài)的多能性細(xì)胞并最終決定其衍生的ESCs的多能性狀態(tài)。因此，本研究擬探討不同發(fā)育階段胚胎的多能性基因表達(dá)模式及其對(duì)分離培養(yǎng)水牛類ESCs效果的影響，并分析其所處的多能性狀態(tài)，以期確定

2、適合水牛類ESCs分離培養(yǎng)的囊胚發(fā)育階段。
　　首先，對(duì)水牛不同發(fā)育階段早期胚胎（桑椹胚、早期囊胚、囊胚、擴(kuò)張囊胚和孵化囊胚）的多能性相關(guān)基因的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)多能性基因主要在桑椹胚和早期囊胚表達(dá)，原始態(tài)相關(guān)基因KLF4、TBX3和REX-1在這兩個(gè)階段高水平表達(dá);囊胚是一個(gè)相對(duì)沉默的基因表達(dá)時(shí)期，大部分多能性基因表達(dá)下調(diào);擴(kuò)張囊胚中KLF4、TBX3和REX-1表達(dá)量較低且高表達(dá)始發(fā)態(tài)相關(guān)基因FGF5。對(duì)培養(yǎng)至第5天的水

3、牛胚胎進(jìn)行2i(1μmol/mL PD0325901，3μmol/mL CHIR99021)培養(yǎng)處理，發(fā)現(xiàn)2i培養(yǎng)處理對(duì)水牛囊胚形成、囊胚細(xì)胞數(shù)、以及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)含量無顯著影響，其多能性基因表達(dá)模式與非處理組相似，但表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組;其多能性沉默階段延長至擴(kuò)張囊胚和孵化囊胚。
　　其次，比較了不同發(fā)育階段囊胚對(duì)分離培養(yǎng)水牛類ESCs的效果，并對(duì)所獲得的類ESCs進(jìn)行了生物學(xué)特性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)張囊胚和孵化囊胚的ICM的貼壁率和

4、原始克隆形成率均顯著高于早期囊胚和囊胚;2i培養(yǎng)處理早期胚胎后，孵化囊胚源原始克隆直徑顯著大于對(duì)照組(P＜0.05);對(duì)不同來源水牛類ESCs原代克隆進(jìn)行核心轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，其OCT4的表達(dá)不受囊胚時(shí)期來源和2i處理早期胚胎的影響，NANOG和SOX2在擴(kuò)張囊胚源類ESCs的相對(duì)表達(dá)顯著高于孵化囊胚源類ESCs，2i處理早期胚胎組原始態(tài)基因KLF4、TBX3和REX-1的表達(dá)高于對(duì)照組，孵化囊胚TBX3和REX-1表達(dá)顯著高于擴(kuò)張

5、囊胚源類ESCs。對(duì)傳代培養(yǎng)的水牛類ESCs進(jìn)行生物學(xué)特性分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈克隆樣生長，表達(dá)多能性轉(zhuǎn)錄因子OCT4、NANOG、SOX2、c-MYC、CDH1、KLF4和TBX3;免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)OCT4、SOX2蛋白，弱表達(dá)SSEA1、SSEA4和TRA-1-60表面抗原;經(jīng)誘導(dǎo)能形成可表達(dá)GATA4、TUBB3、ACTA2和AFP三個(gè)胚層標(biāo)記基因的擬胚體，能分化形成成纖維樣、上皮樣和神經(jīng)樣細(xì)胞。
　　最后，通過檢測(cè)細(xì)胞X

6、性染色體活性狀態(tài)、相關(guān)多能性基因表達(dá)情況和對(duì)不同多能性信號(hào)的反應(yīng)，以分析雌性水牛類ESCs所處的多能性狀態(tài)。結(jié)果顯示:雌性水牛類ESCs有一條X染色體隨機(jī)失活;通過RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，水牛類ESCs表達(dá)原始態(tài)相關(guān)基因KLF4和TBX3，不表達(dá)REX-1，而表達(dá)始發(fā)態(tài)基因FGF5和ACTA2;免疫組化以及Western blot檢測(cè)再次證實(shí)水牛類ESCs表達(dá)FGF5，不表達(dá)REX-1;水牛類ESCs在細(xì)胞因子LIF和bFGF下較好維持其

7、多能性狀態(tài)，其次是與始發(fā)態(tài)相關(guān)的細(xì)胞因子bFGF和Noggin，在原始態(tài)相關(guān)細(xì)胞因子LIF+BMP4中較難維持其多能性狀態(tài)。水牛類ESCs的基因表達(dá)模式和對(duì)信號(hào)的反應(yīng)顯示與始發(fā)態(tài)多能性干細(xì)胞更接近。
　　以上結(jié)果表明:(1)水牛早期胚胎多能性基因表達(dá)主要集中在桑椹胚和早期囊胚，囊胚是水牛相對(duì)沉默的的多能性階段，但經(jīng)2i處理早期胚胎后囊胚的多能性沉默期延遲到擴(kuò)張囊胚期;(2)水牛擴(kuò)張囊胚和孵化囊胚有利于類ESCs的衍生，經(jīng)2i處理早