復(fù)合功能型酸敏納米藥物運(yùn)載體系的制備及性質(zhì)研究.pdf

1、在腫瘤化療中，發(fā)展和完善安全高效的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和技術(shù)是促進(jìn)藥物臨床應(yīng)用的關(guān)鍵?，F(xiàn)階段的抗腫瘤藥物通常有極高的生物毒性且缺少特異選擇性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)影響到正常組織細(xì)胞。作為理想的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，它必須具有較長(zhǎng)的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間和適宜的穩(wěn)定性，能夠保護(hù)藥物在正常組織的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中不提前滲漏或失活；能夠靶向特異的病灶部位并在外部刺激的作用下釋放藥物。為了實(shí)現(xiàn)這一想法，許多藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)被賦予了一定的功能特性，如pH敏感脂質(zhì)體、膠束、引入靶

2、向基團(tuán)的聚合物納米粒及聚合物前藥等。其中，pH響應(yīng)的多功能聚合物納米粒備受關(guān)注。腫瘤細(xì)胞由于糖的無(wú)氧酵解旺盛產(chǎn)生大量乳酸，使其細(xì)胞內(nèi)pH值低于正常細(xì)胞，相差約0.7pH。腫瘤細(xì)胞外pH在6.5-7.2之間，細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)涵體和溶酶體則酸性更強(qiáng)，分別在5.0-6.5之間和4.5-5.0之間。正常組織的pH為一個(gè)恒定值7.4。這種pH的顯著性差異可作為實(shí)體瘤治療的突破口。因此，結(jié)合納米載體本身具有的被動(dòng)靶向特性及表面修飾靶向分子后具有的主動(dòng)靶向

3、特性，pH響應(yīng)型釋藥的靶向納米藥物載體可以更進(jìn)一步提高載體對(duì)腫瘤部位的選擇性、提高藥物對(duì)病灶部位的治療效率，減少藥物的毒副作用。
　　本論文是在pH響應(yīng)型的功能性抗腫瘤納米藥物載體的大背景下展開的。課題研究分別從酸敏載體和酸敏化學(xué)鍵入手，構(gòu)建了三種不同類型的pH響應(yīng)型納米藥物載體。第一部分的研究工作是從酸敏載體的角度出發(fā)，系統(tǒng)的對(duì)比了三種磺胺二甲氧嘧啶衍生物與葡聚糖反應(yīng)后形成的納米載體的理化性質(zhì)，篩選得到一組具有pH敏感特性的納米

4、體系。研究中對(duì)三種納米體系各自的自組裝成粒機(jī)理過程進(jìn)行了探討。第二部分研究工作則從酸敏化學(xué)鍵的角度出發(fā)，將聚合物藥物進(jìn)一步制備成納米粒的形式，并同時(shí)包封其他疏水性的藥物，共同發(fā)揮作用。但是研究中我們發(fā)現(xiàn)，該納米載體不可避免的會(huì)感應(yīng)腫瘤細(xì)胞外pH釋藥。且胞外釋放的藥物有可能重新擴(kuò)散分布到正常組織，降低藥物的靶向特異性。因此，在前面這兩部分工作的基礎(chǔ)上，第三部分的研究工作中我們采用酸敏載體和酸敏化學(xué)鍵相結(jié)合的策略，針對(duì)腫瘤耐藥細(xì)胞，構(gòu)建了一

5、組新型復(fù)合功能的pH響應(yīng)型藥物載體，并以一種新穎且簡(jiǎn)單的方法引入并保護(hù)穿膜肽。與文獻(xiàn)報(bào)道的繁瑣的屏蔽-去屏蔽保護(hù)方法相比，更具有可行性。分別考察了納米藥物載體的形態(tài)、粒徑、表面電荷，臨界膠束濃度等理化性質(zhì)及酸敏特性，并進(jìn)行了初步的體外抗腫瘤活性研究。具體內(nèi)容如下：
　　第一部分馬來?；暇厶?磺胺二甲氧嘧啶（Dex-MA/SD）納米載體的制備及其性質(zhì)研究
　　以葡聚糖和酸敏材料磺胺二甲氧嘧啶為主要原料，首先合成出三種葡聚糖/

6、磺胺二甲氧嘧啶的系列衍生聚合物：馬來?；暇厶?磺胺二甲氧嘧啶（Dex-MA/SD），馬來酰化葡聚糖/聚磺胺二甲氧嘧啶（Dex-MA/PSD）和葡聚糖/羧基化磺胺二甲氧嘧啶（Dex/COOH-OSDM）。通過調(diào)節(jié)親水鏈段和疏水鏈段的比例，篩選出當(dāng)Dex-MA/SD體系中Dex-MA:SD為1:3（w/w），Dex-MA/PSD體系中Dex-MA:PSD為2:3（w/w），Dex/COOH-OSDM體系中Dex:COOH-OSDM為4:3

7、（w/w）時(shí)，由透射電鏡觀察制備的納米粒粒徑均勻（100nm左右），分散性較好。實(shí)驗(yàn)中系統(tǒng)對(duì)比了SD、PSD及COOH-OSDM與改性葡聚糖或葡聚糖反應(yīng)后形成的三種納米體系的理化性質(zhì)，并選擇在pH7.4的去離子水中透析成納米粒，形成了一種與之前文獻(xiàn)報(bào)道的不同的納米粒結(jié)構(gòu)。芘熒光法測(cè)定的Dex-MA/SD，Dex-MA/PSD和Dex/COOH-OSDM的臨界聚集濃度分別是3.0μg/mL，4.9μg/mL，5.2μg/mL。臨界聚集濃度

8、越小，表明該體系就越穩(wěn)定。自組裝成粒后，三者的zeta電位分別是-47.1mV，-28.3mV，-8.18mV。在隨后的粒徑和zeta電位隨pH變化的研究中，只有Dex-MA/SD納米體系表現(xiàn)出了pH敏感性，另兩組則沒有。由此，根據(jù)三種納米體系的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)對(duì)三種納米體系成粒機(jī)理進(jìn)行了探討。結(jié)果表明：Dex-MA/SD納米體系因其表面帶有部分的SD基團(tuán)具有更靈敏的酸敏特性，優(yōu)于后兩組。pH7.4時(shí)，Dex-MA/SD粒徑為92nm。pH6.

9、8時(shí)，其粒徑迅速增大到222nm。體外模擬釋藥性質(zhì)的研究中，選用阿霉素為藥物模型。Dex-MA/SD納米粒在pH7.4，pH7.0，pH6.8，pH6.0的介質(zhì)中釋藥2h后，其藥物累積釋放率分別是6.0％，13.2％，20.0％，24.0％。隨著pH的依次減小，相同時(shí)間內(nèi)藥物累積釋放率依次增大。pH6.0時(shí)，20h內(nèi)藥物累積釋藥率接近75％。在體外腫瘤細(xì)胞內(nèi)攝作用的研究中，pH6.0，pH6.8時(shí)，細(xì)胞內(nèi)阿霉素的熒光強(qiáng)度明顯高于pH7.

10、4時(shí)的熒光強(qiáng)度。表明在Dex-MA/SD納米粒的作用下，pH6.0，pH6.8時(shí)阿霉素進(jìn)入細(xì)胞的量要多于pH7.4的情況，這也是和體外模擬釋藥實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相吻合的。這些結(jié)果表明Dex-MA/SD納米載體具有顯著的pH敏感釋藥特性，可有望成為一種pH響應(yīng)釋藥的抗腫瘤藥物載體。
　　第二部分共轉(zhuǎn)運(yùn)阿霉素（Dox）和吡咯烷硫氨甲酸銨（PDTC）的葉酸-普魯蘭多糖-阿霉素（FA-MP-Dox）聚合物納米載體的制備及其性質(zhì)研究
　　克服

11、腫瘤多藥耐藥是癌癥化療中的一個(gè)瓶頸問題，如何克服外排蛋白作用，提高藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的濃度成為解決腫瘤耐藥性的關(guān)鍵問題。經(jīng)特異性配體修飾的納米粒具有主動(dòng)尋靶的特性，可以在一定程度上緩解腫瘤細(xì)胞耐藥性的影響。此外，當(dāng)NF-κB抑制劑與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，NF-κB抑制劑可增強(qiáng)放化療的治療效果，亦能達(dá)到降低耐藥性的效果。但是現(xiàn)階段的藥物輸送體系亟需解決的問題是載藥能力太低。如在納米顆粒載體或脂質(zhì)體內(nèi)，載藥量一般不超過10％。因此在本部分實(shí)驗(yàn)中

12、，利用酸敏連接臂酰胺鍵將藥物阿霉素鍵合到葉酸-普魯蘭多糖的聚合物鏈上，將FA-MP-Dox聚合物藥物進(jìn)一步制備得到聚合物納米粒，并同時(shí)包封抗腫瘤藥物Dox和目前最有效的NF-κB活性抑制劑PDTC，得到FA-MP-Dox/PDTC+Dox納米體系。通過化學(xué)鍵合和包封相結(jié)合的方法提高體系的載藥率。其中FA-MP-Dox聚合物中阿霉素和葉酸的含量為7.5wt％，2.0wt％。納米粒粒徑在152nm左右，形態(tài)圓整。兩種藥物的釋放呈現(xiàn)出較強(qiáng)的p

13、H依賴性。30h后，pH5.0和pH7.4時(shí)，阿霉素的藥物累積釋藥率分別達(dá)到53％和26％。這是由于在pH5.0時(shí)部分酰胺鍵發(fā)生酸解斷鍵，F(xiàn)A-MP-Dox體系中鍵合的阿霉素逐漸被釋放出來，造成納米粒結(jié)構(gòu)逐步解離。在此時(shí)的酸性環(huán)境中，游離的阿霉素帶有正電荷，藥物分子間產(chǎn)生靜電斥力，從而加速釋放出包封的藥物。以阿霉素敏感的A2780細(xì)胞和耐藥的A2780/DOXR為體外腫瘤細(xì)胞模型，分別研究了不同納米體系的細(xì)胞毒性和內(nèi)攝作用。對(duì)于耐藥A2

14、780/DOXR，F(xiàn)A-MP-Dox/PDTC+Dox納米粒的細(xì)胞毒性（IC50為9.8μM）比MP-Dox/PDTC+Dox（IC50為20μM）的細(xì)胞毒性顯著增強(qiáng)。阿霉素由于細(xì)胞耐藥性的存在，細(xì)胞毒性相對(duì)較弱。因此受體介導(dǎo)的納米粒一定程度上緩解了腫瘤細(xì)胞的耐藥性的影響。此外，對(duì)于A2780細(xì)胞來說，F(xiàn)A-MP-Dox/PDTC+Dox納米粒的細(xì)胞毒性（IC50=2.0μM）同樣高于MP-Dox/PDTC+Dox（IC50=7.5μM

15、）。但是此時(shí)FA-MP-Dox/PDTC+Dox納米粒卻沒有阿霉素（IC50=0.17μM）的細(xì)胞毒性強(qiáng)。在內(nèi)攝作用研究中，對(duì)于A2780/DoxR來說，F(xiàn)A-MP-Dox/PDTC+Dox納米粒的入胞程度遠(yuǎn)高于MP-Dox/PDTC+Dox納米?；蛴坞xDox，且主要分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。沒有包封PDTC的FA-MP-Dox/Dox納米粒中釋放的阿霉素在細(xì)胞膜周圍分布的較少，從而證實(shí)除葉酸分子的靶向作用外，F(xiàn)A-MP-Dox/PDTC

16、+Dox納米體系在PDTC的協(xié)同作用下，進(jìn)一步提高了阿霉素在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的濃度，在一定程度上克服了腫瘤細(xì)胞的耐藥性。
　　第三部分包載Dox-TAT的促黃體生成素釋放激素-聚乙二醇-聚組氨酸-阿霉素（LHRH-PEG-PHIS-Dox）納米載體的制備及其性質(zhì)研究
　　研究中我們發(fā)現(xiàn)，即使采用共轉(zhuǎn)運(yùn)耐藥逆轉(zhuǎn)劑和化療藥物的方法來對(duì)抗多藥耐藥性，納米載體仍不可避免的在胞外釋藥，降低藥物的靶向特異性。因此，生物活性分子的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)仍是

17、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的一個(gè)關(guān)鍵問題。穿膜肽（如TAT）具有細(xì)胞膜親和性高、穿膜速度快、降解迅速等優(yōu)勢(shì)，可直接帶領(lǐng)大分子或藥物穿過細(xì)胞膜，尤其是對(duì)于耐藥細(xì)胞同樣有效?；谶@一點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)中選用更為適合的酸敏材料，采用酸敏載體和酸敏化學(xué)鍵相結(jié)合的策略，制備了LHRH-PEG-PHIS-Dox/Dox-TAT載藥膠束。芘熒光法測(cè)定LHRH-PEG-PHIS-Dox的臨界膠束濃度為4.9μg/mL，表明該體系具有較好的穩(wěn)定性。當(dāng)pH從8.0減小到5.0的時(shí)候

18、，粒徑從78nm迅速增大到158nm，粒徑隨pH的減小而增大。在體外模擬釋藥性質(zhì)的研究中，20h后，在pH6.8的釋放介質(zhì)中，LHRH-PEG-PHIS-Dox/Dox-TAT的累積釋藥率為67％，而在pH7.4的環(huán)境下，藥物累積釋放率還不到19％。這是因?yàn)樵趐H<7.0時(shí)，膠束溶脹，粒徑變大，利于藥物的滲透釋放，另外此時(shí)膠束自身帶有了部分正電，與正電性的Dox-TAT間產(chǎn)生靜電斥力，從而也可加速藥物的釋放。粒徑、zeta電位和體外模擬

19、釋藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)LHRH-PEG-PHIS-Dox/Dox-TAT具有靈敏的pH響應(yīng)特性。在細(xì)胞毒性的研究中，包封Dox-TAT的LHRH-PEG-PHIS-Dox納米體系在pH6.8時(shí)的細(xì)胞毒性強(qiáng)于包封Dox的LHRH-PEG-PHIS-Dox和LHRH-PEG-PHIS-Dox納米體系。流式細(xì)胞儀分析和內(nèi)攝作用研究的結(jié)果亦表明：pH6.8時(shí)，包封Dox-TAT的LHRH-PEG-PHIS-Dox納米體系入胞后的熒光強(qiáng)度相對(duì)最高，且在

20、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布。這說明釋放的Dox-TAT在TAT的作用下，可避開耐藥性的影響，快速進(jìn)入細(xì)胞。綜上所述，在這個(gè)體系中，阿霉素以酸敏連接臂酰胺鍵鍵合到PHIS的鏈端，既增強(qiáng)了膠束的穩(wěn)定性，同時(shí)又提高了載藥率。并且利用聚組氨酸不同pH時(shí)的溶解性差異，有效控制Dox-TAT藥物的釋放，以一種新穎且簡(jiǎn)單易行的方法保護(hù)了TAT。LHRH-PEG-PHIS-Dox/Dox-TAT綜合了超酸敏材料聚組氨酸和穿膜肽TAT的優(yōu)良特性，可有望成為