棉鈴蟲中腸APN活力測定及Bt毒素受體APN1的表達純化.pdf

1、轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉是我國棉花害蟲綜合防治的重要手段之一，轉(zhuǎn)Bt基因棉花種植面積的快速增長，使其主要靶標昆蟲棉鈴蟲Helicoverpaarmigera存在產(chǎn)生抗性的風(fēng)險。一旦棉鈴蟲對Bt轉(zhuǎn)基因棉花產(chǎn)生抗性，會威脅各種Bt制劑、轉(zhuǎn)Bt基因棉花和其他Bt作物的使用壽命。棉鈴蟲Bt抗性機理的研究是抗性監(jiān)測、風(fēng)險預(yù)測和抗性治理的基礎(chǔ)，對于合理、有效使用Bt，延長轉(zhuǎn)Bt基因棉使用壽命有重要的意義。氨肽酶N(AminopeptidaseN)已被確認為

2、多種昆蟲中腸Bt毒蛋白在的主要受體，但APN與昆蟲Bt抗性產(chǎn)生的關(guān)系還存在很多爭議，重組棉鈴蟲APN蛋白對其功能進行研究對棉鈴蟲Bt抗性機制的研究有重要意義。 本研究利用本實驗室篩選的棉鈴蟲Bt試劑敏感品系96S和抗性品系品系BtR，分別克隆幼蟲中腸氨肽酶N1(APN1)基因的去信號肽片斷，比較預(yù)測氨基酸序列得知：APN1/BtR有1個氨基酸缺失，即45蘇氨酸缺失，5個氨基酸發(fā)生突變，即194蘇氨酸→絲氨酸，550纈氨酸→異亮氨

3、酸，861異亮氨酸→蘇氨酸，902丙氨酸→脯氨酸，954蘇氨酸→脯氨酸。 本研究采取了BactoBac表達系統(tǒng)，分別對APN1/96S和APN1/BtR重組表達，該系統(tǒng)具有高效表達，翻譯后修飾，無內(nèi)毒素污染等優(yōu)勢。將APN1克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTb，將重組質(zhì)粒pFastBacHTb-APN1轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細胞，發(fā)生體內(nèi)重組，獲得桿粒Bacmid-APN1。桿粒DNA在脂質(zhì)體Lipofecti

4、n介導(dǎo)下侵染粉紋夜蛾Trichoplusiani細胞(Tn-5B1-4)，獲得含APN1基因的重組桿狀病毒，重組病毒感染Tn細胞后，表達目的蛋白。SDS-PAGE分析和Ligandblot配體雜交顯示，目的蛋白成功表達，重組蛋白APN1/96S和APN1/BtR在變性條件下均能與Cry1Ac毒素結(jié)合。 測定病毒滴度，以MOI=3.0大量感染并收獲細胞，由于重組蛋白帶有His-tag標記，細胞破碎后，采用HisTrapNi離子親和

5、層析柱純化重組蛋白，Ni離子親和層析柱吸附His-tag標記蛋白，以高濃度咪唑洗脫結(jié)合蛋白。SDS-PAGE分析和Ligandblot配體雜交顯示，成功純化重組蛋白。 本研究通過比較棉鈴蟲敏感、抗性品系幼蟲中腸前部和后部BBMV中APN活力，驗證APN的活力是否與昆蟲Bt抗性相關(guān)。結(jié)果表明APN活力在中腸前部和后部的分布符合APN作為Bt毒素受體的功能，但敏感、抗性的幼蟲之間中腸各部的APN活力沒有顯著差異。為APN活力與昆蟲B