棉鈴蟲(chóng)、甜菜夜蛾中腸受體蛋白與Bt毒素結(jié)合能力的研究.pdf

1、棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera(Hübner)和甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)都是寄主范圍廣泛的重要夜蛾科害蟲(chóng)。我國(guó)自1997年種植轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉花，Bt（Bacillus thuringiensis）棉花的種植不僅有效的控制了棉花上棉鈴蟲(chóng)的種群，而且減輕了其他作物上棉鈴蟲(chóng)的為害，但目前種植的表達(dá)Cry1Ac蛋白的抗蟲(chóng)棉對(duì)甜菜夜蛾的防治效果較差。轉(zhuǎn)雙價(jià)抗蟲(chóng)棉花（表達(dá)Cry1Ac+Cry2Ab蛋白

2、）可以延緩棉鈴蟲(chóng)等靶標(biāo)害蟲(chóng)的抗性發(fā)展，還可以擴(kuò)大殺蟲(chóng)譜，同時(shí)防治包括甜菜夜蛾在內(nèi)的多種鱗翅目害蟲(chóng)，現(xiàn)已在多個(gè)國(guó)家廣泛種植。人們認(rèn)為 Cry2A與 Cry1A類(lèi)蛋白存在不同的殺蟲(chóng)機(jī)制，但關(guān)于Cry2A類(lèi)蛋白的作用機(jī)制還研究較少。本文首先比較了棉鈴蟲(chóng)中腸不同受體蛋白（鈣粘蛋白、氨肽酶N、堿性磷酸酯酶）與Cry1Ac、Cry2Aa的結(jié)合能力，克隆了甜菜夜蛾的中腸堿性磷酸酯酶2（ALP2）的基因，證實(shí)了甜菜夜蛾中腸ALP2是Cry1Ac的一種結(jié)

3、合蛋白后，進(jìn)一步比較了棉鈴蟲(chóng)、甜菜夜蛾的ALP2與Cry1Ac、Cry2Aa結(jié)合能力的差異。研究結(jié)果可為進(jìn)一步明確Cry2A蛋白的作用機(jī)制、合理種植應(yīng)用雙價(jià)抗蟲(chóng)棉等提供依據(jù)。結(jié)果如下：
　　1.利用ELISA動(dòng)力學(xué)方法，比較了Cry1Ac和Cry2Aa毒素與棉鈴蟲(chóng)中腸受體的結(jié)合能力。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：活化的Cry1Ac、Cry2Aa殺蟲(chóng)蛋白都能與原核表達(dá)的鈣念蛋白（CAD）、氨肽酶N（APN）、堿性磷酸酶（ALP）受體結(jié)合。其與Cry

4、1Ac殺蟲(chóng)蛋白的結(jié)合能力分別是：0.2519nM，245.nM，121.7nM；與Cry2Aa殺蟲(chóng)蛋白的結(jié)合能力分別是：0.836nM，9.813nM，47.91nM。
　　2.為明確甜菜夜蛾中腸堿性磷酸酶是Cry1Ac殺蟲(chóng)蛋白的受體，利用同源克隆和RACE技術(shù)，克隆編碼甜菜夜蛾中腸alp2完整的cDNA序列，結(jié)果表明該序列全長(zhǎng)1629 bp（已經(jīng)在 GenBank中登記，序列號(hào)為KP420013），編碼542個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)在氨基

5、酸序列N端包含一個(gè)21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，在C端存在一個(gè)GPI修飾的錨定位點(diǎn)，以及在整個(gè)氨基酸序列中存在多個(gè)糖基化修飾位點(diǎn)。
　　3.利用熒光定量 PCR比較了甜菜夜蛾幼蟲(chóng)中腸不同齡期 ALP2表達(dá)量的差異，結(jié)果表明ALP2在每個(gè)齡期均有表達(dá)，但是1齡幼蟲(chóng)ALP2表達(dá)量最低，4齡最高。利用Ligand blot方法檢測(cè)了甜菜夜蛾中腸 ALP2與Cry1Ac殺蟲(chóng)蛋白的結(jié)合，結(jié)果表明原核表達(dá)的 ALP2片段與活化的Cry1Ac殺蟲(chóng)蛋白可