無梗五加果多糖與黃酮化合物的提取純化及生物活性研究.pdf

1、無梗五加，又名短梗五加，是五加科五加屬植物，具有廣泛的藥理活性，長期以來，在東北地區(qū)，代替刺五加藥用，未見不良反應(yīng)報道。其根皮即五加皮，具有悠久的藥用歷史，嫩莖俗稱刺拐棒，是具有保健功能的山野菜，其果粉碎后制成的果茶，具有抗疲勞、降血壓等功效。我省是無梗五加資源分布較廣的地區(qū)，已實(shí)現(xiàn)人工栽培，因此開發(fā)該資源前景廣闊。目前，對無梗五加的研究主要集中在根、莖、葉部位，對無梗五加果化學(xué)成分及其生物活性的研究報道很少，對黃酮化合物的研究未見報道

2、。多糖和黃酮類化合物是植物中具有廣泛生物活性的物質(zhì)，本文對無梗五加果的多糖和黃酮化合物的提取純化及生物活性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，主要結(jié)論如下： 1.采用水提醇沉法提取無梗五加果多糖，由正交試驗(yàn)得出最佳工藝條件為：浸提溫度80℃，料液比1：70，提取時間3h。以提取兩次為宜。提取液醇沉?xí)r，以5倍醇沉為宜。 2.從脫蛋白率和多糖保留率方面比較，Sevag法比三氯乙酸法更適于無梗五加果多糖中蛋白的脫除，最佳工藝參數(shù)為粗多糖液與Sev

3、ag試劑的體積比為4：1，氯仿和正丁醇的體積比為3：1。 3.脫蛋白脫色素后的精制多糖ASP經(jīng)高效液相色譜分析，其單糖組成主要為核糖、果糖、甘露糖和半乳糖。硫酸咔唑反應(yīng)表明其為酸性多糖。 4.分別采用pH7.8的磷酸緩沖液和水對DEAE-52柱進(jìn)行平衡，以蒸餾水、0.1～0.5MNaCL洗脫多糖，發(fā)現(xiàn)水平衡條件下，更利于多糖洗脫；在兩種不同的柱平衡條件下，相同離子強(qiáng)度的洗脫劑洗脫下的多糖組分不同。兩種柱平衡條件下，洗脫所

4、得主要多糖組分ASPⅡ-B2和ASPⅠ-B2純度、分子量及單糖組成均不同。 5.采用HPLC-GPC對DEAE-52洗脫下的主要多糖ASPⅡ-B2和ASPⅠ-B2純度和分子量測定表明，ASPⅡ-B2有8個高分子物質(zhì)峰，其分子量分別為180.7Kd,179.1Kd,147.0Kd，45.4Kd，21.8Kd，11.7Kd，7.8Kd和4.3Kd。ASPⅠ-B2有5個高分子物質(zhì)峰，其分子量分別為179.5Kd,21.0Kd,11.6

5、Kd，7.7Kd,和4.3Kd。 6.經(jīng)HPLC法檢測ASPⅡ-B2和ASPⅠ-B2單糖組成，共檢出：甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖共9種單糖，其中ASPⅡ-B2以半乳糖含量最高，占37.74％，其次為葡萄糖，為12.60％，鼠李糖為7.66％。糖醛酸含量較高，為酸性多糖。ASPⅠ-B2以葡萄糖和半乳糖含量居多，二者含量相差不大，分別為20.20％和22.92％，其次為鼠李糖9.

6、46％，也為酸性多糖。紅外光譜分析表明，二者均具有吡喃環(huán)特征吸收，既有α又有β糖苷鍵，為酸性糖。 7.采用HPLC-GPC對水平衡條件下DEAE-52洗脫下的多糖ASPⅡ-A的純度和分子量測定表明，ASPⅡ-A為均一組分，分子量為18.1KD，經(jīng)高效液相色譜分析其單糖組成主要為：半乳糖和鼠李糖。紅外光譜分析表明其為中性多糖。 8.化學(xué)發(fā)光法表明，無梗五加果多糖具有清除羥基自由基和超氧自由基的作用。抗油脂試驗(yàn)表明，具有抗油

7、脂氧化的性能。此外，具有一定的抑菌作用。初步的動物試驗(yàn)表明，無梗五加果多糖具有抗疲勞、耐缺氧和提高免疫力的作用。 9.硝酸鋁顯色法適于無梗五加果黃酮含量的測定，回收率為98.35％。正交試驗(yàn)表明，乙醇回流法提取無梗五加果黃酮的最佳提取條件為醇濃度50％，料液比1：80，提取時間4h，提取1次。 10.在進(jìn)行篩選的8種樹脂中，HPD600對黃酮的吸附量大，吸附率較高，易解吸，屬快速吸附型樹脂，是一種理想的黃酮吸附劑，適宜于

8、對黃酮的提取分離。當(dāng)上樣液pH為5.06，濃度為0.5mg/mL，上樣液與樹脂用量之比為10：1，控制流速為1mL/min時，HPD600對黃酮的吸附率可達(dá)93.04％。低溫有利于HPD600樹脂的吸附，而高溫則有利于該樹脂的解吸。體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇對黃酮的洗脫率最高，且洗脫物中黃酮純度最高，控制解吸流速為1.0mL/min，洗脫體積為三倍柱床體積時，基本可以將黃酮完全洗脫下來。最終產(chǎn)品黃酮純度可達(dá)86.79％。 11.經(jīng)顯

9、色反應(yīng)和紫外光譜掃描初步鑒別無梗五加果黃酮化合物類型可能為黃酮、黃酮醇、異黃酮。對無梗五加果總黃酮最佳層析體系進(jìn)行了篩選，表明以聚酰胺為固定相、正丁醇-乙酸-水(4：1：5)或微乳液為展開劑效果較好。薄層定性分析表明，無梗五加果中不含蘆丁和槲皮素。但含有藥用成份金絲桃苷。為無梗五加果的開發(fā)利用提供了依據(jù)。 12.采用制備型高效液相從大孔樹脂純化后的無梗五加果總黃酮中分離制備金絲桃苷，產(chǎn)品純度可達(dá)92％以上。與其他方法相比較，省時