高脂飼養(yǎng)大鼠腎臟微血管病變與脂毒性的關系及其機制研究.pdf

1、目的：通過長期高脂飲食飼養(yǎng)的方法建立高脂肥胖大鼠模型；正常血糖高胰島素鉗夾實驗評價其外周胰島素抵抗水平；觀察長期高脂飲食飼養(yǎng)后大鼠腎臟功能及結構的改變；探討脂毒性對腎臟微血管病變的影響及吡格列酮干預的作用，為有效預防和治療本病提供理論依據。 方法：選用8周齡健康雄性SD大鼠45只，體重250g左右，適應性飼養(yǎng)1周后，按照隨機數字表將大鼠隨機分為正常對照組(NC)、高脂飼養(yǎng)組(HF)和高脂飼養(yǎng)+吡格列酮干預組(HP)，每組15只：

2、NC組采用普通飼料喂養(yǎng)，脂肪占總熱量的10％；HF組采用高脂飼料喂養(yǎng)，脂肪含量占總熱量的66％；HP組高脂喂養(yǎng)同時給予吡格列酮15mg·kg-1·d-1劑量灌胃。飼養(yǎng)滿32周后將各組大鼠置于代謝籠中收集24小時尿，用于檢測24小時尿白蛋白定量；采血檢測各項血清學指標；行正常血糖高胰島素鉗夾實驗后處死動物，迅速分離兩側腎臟，觀察腎臟的顏色、質地，留左腎于4％的中性甲醛溶液，用于HE、PAS染色及血管內皮生長因子(VEGF)和細胞間黏附分子

3、-1(ICAM-1)免疫組織化學染色，觀察腎組織結構的改變和VEGF和ICAM-1的表達情況；右腎置于液氮，備檢，用于實時熒光定量PCR法檢測腎皮質VEGF和ICAM-1mRNA的表達；取腹腔、腎囊及睪丸等處脂肪稱重，計為內臟脂肪重量，計算內臟脂肪重量占體重百分比。日本OlympusAU400全自動生化分析儀檢測空腹血糖；放射免疫分析方法測定空腹血清胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)、24小時尿白蛋白定量；酶比色法測定甘

4、油三酯(triglyceride，TG)；酶法測定血清游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)。正常血糖高胰島素鉗夾實驗評價其外周胰島素抵抗水平，行頸靜脈、頸動脈插管，體重恢復后，從頸靜脈導管以微量泵輸入短效胰島素，速率12mU.min-1.kg-1，同時輸注20％葡萄糖溶液。每10min從頸動脈導管取血測定血糖值，根據血糖值調整葡萄糖輸注速度，使血糖穩(wěn)定在5.0±0.2mmol/L，維持120min，計算葡萄糖輸注率(GI

5、R)。HE、PAS染色觀察腎組織病理結構變化，SP法對腎組織標本進行VEGF和ICAM-1免疫組織化學染色，以DAB法顯色，結果以IPP5.1圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析，比較腎小球平均光密度(腎小球著色面積IOD/腎小球總面積)。實時熒光定量PCR檢測腎皮質VEGF及ICAM-1基因表達，用Trizol試劑一步法提取大鼠腎臟總RNA，ReverTra Ace-a cDNA試劑盒合成大鼠腎臟cDNA，采用ABI(R)PRISM 7300實

6、時熒光定量PCR儀進行基因檢測。內參照為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。引物均由上海生工生物公司合成。使用2-△△CT方法計算基因表達情況。 用SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件處理實驗數據，所得數據符合正態(tài)分布的以-x±s表示，偏態(tài)分布的變量數據以中位數表示，并經對數轉換使之正態(tài)化后采用t檢驗及方差分析進行統(tǒng)計分析，若P<0.05或P<0.01 ,則認為兩組數據差異有統(tǒng)計學意義。 結果：1大鼠一般情況和特征：飼養(yǎng)至32

7、周時，HF組和HP組大鼠體重、內臟脂肪重量及內臟脂肪占體重百分比均明顯高于NC組(P均<0.01)。與NC相比，HF組空腹血糖、胰島素、甘油三酯、游離脂肪酸、24小時尿白蛋白定量均明顯升高(P<0.01或P<0.05)；HP組較HF組則有所改善，并且部分數值已接近NC組水平。2大鼠正常血糖高胰島素鉗夾實驗結果比較：從60min開始各組大鼠血糖趨于穩(wěn)定狀態(tài)，HF組的葡萄糖輸注率顯著降低，穩(wěn)定狀態(tài)下平均葡萄糖輸注率僅為(4.8±1.2)mg

8、.min-1.kg-1，NC組穩(wěn)定狀態(tài)下平均葡萄糖輸注率為(11.3±1.7)mg.min-1.kg-1，差別有顯著意義(P<0.01)。HP組為(10.1±1.5)mg.min-1.kg-1與HF組比較明顯改善(P<0.01)。3大鼠腎組織形態(tài)學改變：NC組大鼠。腎小球結構未見明顯異常；HF組出現(xiàn)腎小球病理改變，腎小球體積增大，PAS紅染區(qū)明顯擴大，腎小球毛細血管袢略顯僵硬，系膜基質增生；HP組腎小球體積、PAS紅染區(qū)及系膜基質增生均

9、輕于HF組。4腎皮質VEGF及ICAM-1蛋白的表達：NC組大鼠腎小球中VEGF及ICAM-1基本不表達或弱表達，平均光密度分別為(0.0127、0.0145)；HF組大鼠VEGF、ICAM-1在腎小球內沿毛細血管壁及系膜區(qū)呈線狀表達，較NC組明顯增高(0.0797、0.0653,P均<0.01)；HP組腎小球VEGF、ICAM-1平均光密度分別為(0.0301、0.0148)，但仍略高于NC組(P均<0.05)。5實時熒光定量PCR檢

10、測大鼠腎臟基因表達：與NC組相比，HF組VEGFmRNA表達升高21％(P<0.01)，ICAM-1mRNA表達升43％(P<0.01)；經吡格列酮干預后，HP組VEGF及ICAM-1mRNA表達較NC組均下降，分別為30％和15％(P均＜0.01)。結論：1 通過長期高脂飲食誘導可以成功制備高脂肥胖大鼠模型，具有胰島素抵抗、脂代謝紊亂、糖代謝紊亂等特征。2 長期高脂飼養(yǎng)可導致大鼠腎臟微血管病變，引起24小時尿白蛋白定量增加，可能與高游