抗SSA表位特異性單鏈?zhǔn)删w抗體的可溶性表達(dá)及其致病機(jī)理的研究.pdf

1、抗SSA抗體是見于多種彌漫性結(jié)締組織病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、原發(fā)或繼發(fā)性干燥綜合癥(SS)、亞急性皮膚型狼瘡(SCLE)、新生兒狼瘡(NLE)的重要自身抗體之一，與皮疹、外分泌腺體損傷以及粒細(xì)胞減少等多種臨床癥狀密切相關(guān)<'[1-3]>。SSA抗原是一種廣泛存在人體細(xì)胞內(nèi)的異質(zhì)性核糖核蛋白復(fù)合體，由52kd或60kd蛋白結(jié)合hYRNA構(gòu)成，其抗原性主要存在于蛋白組分。隨著60kd和52kdSSA抗原cDNA克隆成功，Harley等

2、研究發(fā)現(xiàn)SSA抗原由一系列抗體結(jié)合表位構(gòu)成<'[4,5]>，不同表位抗原性不同，不同抗表位抗體出現(xiàn)在不同疾病<'[6,7]>，或與同一疾病的不同臨床表現(xiàn)相關(guān)。我科研究發(fā)現(xiàn)60Kd SSA抗原氨基酸多肽(MAP)310～323和482～495MAPs抗體陽性與唾液腺損傷具有正相關(guān)<'[8]>。Kurein等報(bào)道60Kd抗原與自身免疫性甲狀腺疾病相關(guān)D1抗原存在交叉表位決定簇EKVK，抗SSA抗體可能通過此交叉表位造成SLE患者中性粒細(xì)胞減

3、少<'[9]>。體外實(shí)驗(yàn)中SSA抗原在SLE和SS患者以及動物模型的細(xì)胞膜可以異位表達(dá)，部分SSA抗原表位免疫動物后出現(xiàn)表位擴(kuò)展現(xiàn)象，并誘導(dǎo)出類似SS的腺體損傷<'[10]>提示某些SSA表位在SS發(fā)病和臟器損傷中有重要作用，而且不同表位作用存在差異，可能存在優(yōu)勢致病性表位。抗SSA抗體可能是某些臟器損傷的致病性抗體。 研究目的：利用已構(gòu)建的抗SSA單鏈(ScFv)噬菌體抗體庫，篩選SSA抗原表位特異性單克隆抗體(McAb)，檢

4、測不同表位在受累器官的表達(dá)情況，判斷器官受累是否與不同器官SSA抗原表位的表達(dá)存在相關(guān)性。 方法： 1．以賴氨酸為支架，八倍體合成上述3條氨基酸多肽鏈(MAP)：MAP 482-493：P1表位;MAP310-323：P2表位；MAP 230-241：P3表位； 2．利用已構(gòu)建的噬菌體抗體庫技術(shù)篩選并可溶性表達(dá)P1～P3表位特異性ScFv McAb； 3．檢測SS患者受累唇腺組織和SLE和／或SS合并粒

5、細(xì)胞減少患者中性粒細(xì)胞 表面表位的表位表達(dá)情況； 4．分析表達(dá)與組織器官受損的相關(guān)性。 結(jié)果： 1.驗(yàn)證-70℃凍存SSA特異性Scfv-pHEN2噬菌體抗體庫庫容1.08×10l<'10>cfu，完 整插入片斷插入率55.56％，有較好的多樣性(MSP-1指紋PCR法)； 2.通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法，成功篩選獲得了抗3種表位的含完整插入片斷的克隆株(分別P1:3個克隆P2:6個克隆P3:4個克隆)，其中3

6、個克隆進(jìn)一步由異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(ITPG)誘導(dǎo)以非抑制性大腸桿菌HB215l為宿主細(xì)菌成功可溶性表達(dá)，ScFv抗體由全細(xì)胞可溶組分提取并親和層析純化。經(jīng)驗(yàn)證具有良好的特異性和親和力，并擁有在體活性；3.陽性克隆的基因型與人胚系基因的比較提示來源于人類基因組，VH基因家族分析中，抗P2抗體中VH3家族占有50％，抗P3抗體中VH4家族占75％。3個抗體總體來看VH4家族和VH3家族比例最高分別有46.15％和23.08％。所有

7、抗體的VL均來自K輕鏈，且A家族明顯占優(yōu)勢(P1:100％，P2:66.67％，P3:50％)，同時抗原誘導(dǎo)下出現(xiàn)了較高的突變頻率。4.免疫組化法檢測SS受累唇腺活檢標(biāo)本P1～P3表位的表達(dá)情況，以腺管、泌管上皮細(xì)胞胞漿和胞膜著色為主，P1表位表達(dá)強(qiáng)度高于P2和P3表位，且Pl表位表達(dá)強(qiáng)度與唇腺的炎性浸潤程度呈正相關(guān)關(guān)系。 5.SLE合并粒細(xì)胞減少患者和正常人中性粒細(xì)胞表面P3表位表達(dá)陽性率均明顯高于P1、P2表位(流式細(xì)胞儀檢

8、測)，在SLE合并粒細(xì)胞減少患者粒細(xì)胞表面P3表位與正常人相比表達(dá)明顯上調(diào)，且表達(dá)陽性率與SLE患者粒細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系； 6.SLE和/或SS患者合并粒細(xì)胞減少者血清中抗P3抗體陽性率高于不合并粒細(xì)胞減少者，差異由統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SLE和SS合并粒細(xì)胞減少癥組間抗P3抗體陽性率差異并無顯著性。由此推斷粒細(xì)胞減少可能并不是與SLE相關(guān)，而與相應(yīng)抗體陽性相關(guān)。 結(jié)論： 1.SSA抗原表位在受累組織異位表達(dá)于細(xì)胞膜，從