小鼠肝核苷酸池、核酸池的特征及其與纖維化的作用關(guān)系.pdf

1、肝纖維化是多種慢性肝病的共同病理基礎(chǔ)，是進(jìn)一步向肝硬化發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，有關(guān)肝纖維化機(jī)理方面的研究無論是在細(xì)胞水平上還是在大分子水平上都已經(jīng)相當(dāng)深入，但是在對于細(xì)胞代謝和生命活動(dòng)有著重要影響的小分子及其與大分子作用關(guān)系方面的關(guān)注甚少，尤其是對于核苷酸池的性質(zhì)、動(dòng)力學(xué)特征以及它與基因表達(dá)和纖維化進(jìn)程的關(guān)系的研究尚屬空白。本研究探索了纖維化過程中核苷酸池的性質(zhì)、特點(diǎn)和動(dòng)力學(xué)特征及其與病理過程和差異表達(dá)基因間的關(guān)系，同時(shí)也為纖維化及外源核苷酸緩

2、解纖維化進(jìn)程的作用機(jī)理提供了新的認(rèn)識。
　　采用CCl4誘導(dǎo)的方法建立肝纖維化小鼠模型，肝纖維化進(jìn)程的衡量指標(biāo)為AST、ALT酶活性和肝組織切片觀測。采用HPLC法系統(tǒng)地測定了纖維化過程中CCl4誘導(dǎo)的小鼠和正常小鼠細(xì)胞內(nèi)的核苷酸含量。有關(guān)CCl4誘導(dǎo)的纖維化小鼠的核酸池(代表性差異表達(dá)基因)數(shù)據(jù)是從Ensembl、BioGPS數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)中收集整理的。采用熒光定量PCR技術(shù)測定了核苷酸三個(gè)代謝途徑的關(guān)鍵酶基因和7個(gè)小鼠肝纖維化相

3、關(guān)基因的表達(dá)水平。一磷酸核苷酸(NMP)的含量，AST/ALT的比值以及代表性差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)用來分析核苷酸池、核酸池和纖維化進(jìn)程三者之間的相關(guān)性。
　　酶活測定結(jié)果顯示處理組小鼠的AST、ALT酶活性持續(xù)下降，但都顯著高于對照組。從第8周開始，AST/ALT比值均大于1，指示肝損傷嚴(yán)重。組織切片觀察發(fā)現(xiàn)從第4周開始，處理組有不同程度的肝纖維組織增生，纖維間隔形成，部分見假小葉形成，至第8周時(shí)，纖維化癥狀明顯，而對照組卻無明顯變化

4、。
　　HPLC測定的結(jié)果顯示處理組小鼠肝臟內(nèi)的核苷酸池的表現(xiàn)特征與對照組的存在顯著差別。處理組的核苷酸總含量和NMP含量在肝損傷早期顯著低于對照組，而在纖維化期顯著高于對照組。換言之，處理組小鼠中的核苷酸總含量和NMP的含量在持續(xù)增加，而對照組小鼠中的保持相對恒定。核苷酸池內(nèi)核苷酸含量大小關(guān)系為NMP>>NDP>NTP。
　　實(shí)驗(yàn)中共測定了8種核苷酸：處理組的AMP含量呈上升趨勢，在第2周時(shí)顯著低于對照組(p<0.05)，

5、從第6周開始高于對照組，到第10周時(shí)達(dá)到顯著水平(p<0.01)；處理組的ADP含量在第2周時(shí)顯著低于對照組(p<0.01)，在第4周時(shí)開始上升，到第10周時(shí)顯著高于對照組(p<0.01)；ATP含量在處理組與對照組中沒有顯著性差異。處理組的GMP含量保持上升趨勢，在第2、4、8周與對照組無顯著性差異，在第6周和第10周顯著高于對照組(p<0.01)；處理組的GDP含量在第2、6、8周與對照組無顯著性差異，在第4周顯著低于對照組(p<0

6、.01)，第4周后上升，直至第10周顯著高于對照組(p<0.01)。處理組的UMP含量保持上升趨勢，在第2、4周顯著低于對照組(第2周，p<0.01；第4周，p<0.05)，第6、10周時(shí)顯著高于對照組(p<0.01)，第8周時(shí)與對照組無顯著性差異；處理組的UTP含量保持緩慢上升趨勢，在第2、8周顯著低于對照組(p<0.01)，第4、6、10周時(shí)與對照組無顯著性差異。處理組的CMP含量呈先上升、后稍微下降的變化趨勢，在第2、6周與對照組

7、沒有顯著性差異，在第4周顯著低于對照組(p<0.01)，此后上升，而到第8、10周時(shí)均顯著高于對照組(p<0.01)。
　　對差異表達(dá)基因的分析顯示肝纖維化小鼠模型中，在肝損傷早期下調(diào)的基因占主體，而在纖維化時(shí)期，表達(dá)上調(diào)的基因占大多數(shù)。這種變化趨勢與纖維化過程中肝組織的核苷酸池的變化相一致。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：NMP含量的變化值與相對應(yīng)的差異表達(dá)基因的變化值存在顯著正相關(guān)關(guān)系，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.961(雙尾檢驗(yàn))；NMP的

8、含量與纖維化指標(biāo)(AST/ALT比值)也呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.930(雙尾檢驗(yàn))。
　　核苷酸代謝途徑的關(guān)鍵酶基因表達(dá)水平結(jié)果顯示從頭合成途徑和降解途徑的酶基因表達(dá)無明顯變化，而挽救途徑的腺嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶基因表達(dá)發(fā)生了變化；纖維化相關(guān)的7個(gè)基因的表達(dá)水平測定結(jié)果顯示它們的變化趨勢與已報(bào)道的文獻(xiàn)中的結(jié)果基本一致。
　　肝臟內(nèi)的核苷酸池對于肝臟的生理狀態(tài)有著明顯的影響，核苷酸池和核酸池間的相互作用對