不同年齡和性別影響對(duì)乙酰氨基酚急性肝損傷敏感性差異的機(jī)制研究.pdf

1、背景/目的：
　　對(duì)乙酰氨基酚（APAP）是臨床上兒童常見(jiàn)的解熱鎮(zhèn)痛藥物，其過(guò)量或不當(dāng)使用引起的急性肝臟損傷是兒童藥物性肝損傷的常見(jiàn)原因之一。然而，目前關(guān)于兒童和成人之間APAP急性肝損傷是否存在差異報(bào)道甚少。既往研究表明APAP在肝細(xì)胞內(nèi)經(jīng)P450代謝酶CYP2E1代謝生成有毒產(chǎn)物N-乙酰對(duì)苯醌亞胺（NAPQI），耗竭胞內(nèi)還原型谷胱甘肽（GSH）進(jìn)而引起氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙并最終導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡。近期研究提示，APAP急性肝損

2、傷過(guò)程發(fā)生二次打擊，TLR4信號(hào)可能介導(dǎo)APAP急性肝損傷“二次打擊”過(guò)程中肝細(xì)胞程序性壞死。
　　本課題比較不同年齡和性別小鼠對(duì)APAP急性肝損傷的敏感性差異，為今后更好地指導(dǎo)不同人群APAP肝損傷的臨床治療提供理論依據(jù)；比較野生型（C3H/HeN）與TLR4突變型（C3H/HeJ）小鼠APAP肝損傷的差異，初步探討TLR4在APAP急性肝損傷不同階段的作用。
　　方法：
　　研究一、不同年齡和性別小鼠對(duì)APAP急性

3、肝損傷的敏感性差異由兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組成：實(shí)驗(yàn)一、幼年（3周）CD-1小鼠（雌、雄各10只）和成年（8周）CD-1小鼠（雌、雄各10只）分成四組：幼年雄性小鼠、幼年雌性小鼠、成年雄性小鼠和成年雌性小鼠，每組各10只小鼠。所有小鼠統(tǒng)一禁食12小時(shí)后經(jīng)腹腔注射給予單劑量APAP（300mg/kg），觀察各組小鼠生存情況至APAP給藥后的第7天。繪制各組生存曲線并比較各組小鼠生存率差異。實(shí)驗(yàn)二、幼年（3周）CD-1小鼠（雌、雄各40只）和成年（8周）

4、CD-1小鼠（雌、雄各40只）各分成APAP給藥組和對(duì)照組。所有小鼠統(tǒng)一禁食12小時(shí)。所有APAP給藥組小鼠經(jīng)腹腔注射給予APAP（300mg/kg），對(duì)照組給予生理鹽水。給藥后不同時(shí)點(diǎn)（第0，1，4和24小時(shí)及第7天）剖殺小鼠，比較各組肝指數(shù)，檢測(cè)血清ALT和肝臟GSH、GSSG與GSSG/GSH水平，用HE染色以觀察組織肝臟病理學(xué)損傷，用TUNEL檢測(cè)肝細(xì)胞死亡，用免疫組化檢測(cè)肝臟硝化酪氨酸（3-NT）；用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)肝

5、臟Cyp1a1、Cyp2e1、Cyp3a11、Ugt1a1、Gpx、Gr和Gst基因表達(dá)水平；用試劑盒檢測(cè)肝臟GPX、GR和GST活性；用Western blot檢測(cè)肝臟CYP2E1、p-JNK、JNK、RIP1和RIP3蛋白水平。
　　研究二、TLR4在APAP急性肝損傷發(fā)生過(guò)程中的作用由兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組成：實(shí)驗(yàn)一、野生型（C3H/HeN）小鼠和突變型（C3H/HeJ）小鼠各10只，統(tǒng)一禁食12小時(shí)后給予APAP（300mg/kg）單

6、劑量腹腔注射，觀察各組小鼠生存情況至APAP給藥后72 h。繪制兩組小鼠生存曲線并比較兩組小鼠生存率的差異。實(shí)驗(yàn)二、野生型（C3H/HeN）小鼠和突變型（C3H/HeJ）小鼠各分成APAP給藥組和對(duì)照組。所有小鼠統(tǒng)一禁食12小時(shí)。APAP給藥組小鼠經(jīng)腹腔注射給予APAP（300mg/kg），對(duì)照組給予等體積生理鹽水。給藥后不同時(shí)點(diǎn)（第0，4和12 h）剖殺小鼠，比較兩組小鼠肝指數(shù)，檢測(cè)血清 ALT水平，用 HE染色以觀察肝臟病理學(xué)損傷，

7、用TUNEL檢測(cè)肝細(xì)胞死亡，用Western blot檢測(cè)肝臟p-JNK、JNK以及程序性壞死相關(guān)蛋白激酶RIP1、RIP3蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　幼年小鼠APAP急性肝損傷較同性別成年小鼠更嚴(yán)重。小鼠生存實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，雄性或雌性幼年小鼠生存率（雄性50%、雌性60%）均顯著低于成年小鼠（雄性80%、雌性90%）。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，與同性別成年小鼠相比，給藥后4小時(shí)幼年小鼠肝指數(shù)和血清ALT水平上升更明顯，組織病理學(xué)觀察

8、到肝臟充血明顯；至給藥后24小時(shí)雄性和雌性幼年小鼠血清ALT水平仍明顯高于同性別成年小鼠，組織病理學(xué)觀察到肝臟呈小葉中心性壞死，且幼年小鼠肝臟壞死面積明顯大于同性別成年小鼠；TUNEL檢測(cè)顯示，幼年小鼠肝臟TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于同性別成年小鼠；免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，APAP處理后幼年小鼠肝臟p-JNK和RIP3的蛋白水平均明顯高于同性別成年小鼠。免疫組化顯示，APAP處理后4小時(shí)和24小時(shí)幼年小鼠肝臟硝化酪氨酸（3-NT）陽(yáng)性細(xì)胞

9、數(shù)明顯多于同性別成年小鼠。為探討幼年小鼠對(duì)APAP肝損傷更敏感的機(jī)制，比較了不同年齡和性別小鼠肝臟APAP代謝酶水平和GSH代謝情況。結(jié)果顯示，與同性別成年小鼠相比，幼年小鼠在APAP給藥后肝臟GSH耗竭量更大，GSSG/GSH比值上升更明顯；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，幼年小鼠肝臟Cyp2e1、Cyp3a11的 mRNA水平和CYP2E1蛋白含量均較同性別成年小鼠更高。本課題發(fā)現(xiàn)，APAP急性肝損傷性別差異只存在于成年小鼠，成年雄性小鼠APAP急

10、性肝損傷較成年雌性小鼠更嚴(yán)重。APAP處理后4小時(shí)和24小時(shí)成年雄性小鼠血清ALT水平均高于成年雌性小鼠；組織病理學(xué)觀察到成年雄性小鼠肝臟壞死面積明顯大于成年雌性小鼠；TUNEL檢測(cè)提示，成年雄性小鼠肝臟 TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于成年雌性小鼠。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，APAP處理后4小時(shí)成年雄性小鼠肝臟p-JNK水平明顯高于成年雌性小鼠；免疫組化顯示，APAP處理后4小時(shí)和24小時(shí)成年雄性小鼠肝臟3-NT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯多于成年雌性小鼠。AP

11、AP處理后4小時(shí)成年雄性小鼠肝臟GSH消耗量較成年雌性小鼠大，且GSSG/GSH比值恢復(fù)速度明顯慢于成年雌性小鼠；成年雄性小鼠肝臟GPX和GST活性均低于成年雌性小鼠。
　　野生型（C3H/HeN）小鼠APAP急性肝損傷較突變型（C3H/HeJ）小鼠更嚴(yán)重。72h生存曲線結(jié)果提示野生型（C3H/HeN）小鼠給藥4小時(shí)后即發(fā)生死亡，72小時(shí)生存率為40%；（C3H/HeJ）小鼠至給藥8小時(shí)才發(fā)生死亡，72小時(shí)生存率為70%。故野生型

12、（C3H/HeN）小鼠較突變型（C3H/HeJ）小鼠生存率低。APAP處理4 h后，C3H/HeN小鼠肝指數(shù)較C3H/HeJ小鼠上升明顯。給藥4 h和12 h，C3H/HeN小鼠血清ALT水平均較C3H/HeJ小鼠高。肝臟HE染色提示，C3H/HeN小鼠肝臟壞死面積較大。肝臟TUNEL結(jié)果提示，C3H/HeN小鼠肝臟TUNEL+陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯多于C3H/HeJ小鼠。C3H/HeN小鼠在給藥后的4 h和12 h，肝臟p-JNK的表達(dá)均高于

13、C3H/HeJ小鼠。給藥后4 h，C3H/HeN小鼠肝臟RIP1的表達(dá)高于C3H/HeJ小鼠；給藥后12 h，C3H/HeN小鼠肝臟RIP1的表達(dá)與C3H/HeJ小鼠無(wú)差異，但肝臟RIP3的表達(dá)明顯高于C3H/HeJ小鼠。
　　結(jié)論：
　　不同年齡小鼠對(duì) APAP急性肝損傷存在敏感性差異，幼年小鼠更易于發(fā)生APAP急性肝臟損傷。其機(jī)制可能與幼年小鼠肝臟 Cyp2e1、Cyp3a11的 mRNA水平和CYP2E1蛋白含量均較同

14、性別成年小鼠更高；幼年小鼠對(duì)于APAP引起的肝臟GSH耗竭更敏感；APAP處理后幼年小鼠肝臟P-JNK和RIP3蛋白表達(dá)更高有關(guān)。APAP急性肝損傷的性別差異只存在于成年小鼠，具體表現(xiàn)為成年雄性小鼠比成年雌性小鼠肝臟損傷更明顯。其機(jī)制可能與成年雄性小鼠肝臟GSH代謝酶（GPX和 GST）活性比成年雌性小鼠低，APAP處理后成年雄性小鼠肝臟 GSH消耗多，進(jìn)而抗氧化以及促進(jìn)有毒代謝產(chǎn)物的排出能力降低，加劇肝細(xì)胞JNK持續(xù)性激活，繼而導(dǎo)致肝