細(xì)胞外分泌蛋白CTHRC1在HPV16-18陽(yáng)性的宮頸組織中的表達(dá)和宮頸癌細(xì)胞中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：宮頸癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的癌癥之一，其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。細(xì)胞外分泌蛋白作為腫瘤微環(huán)境重要成分之一在腫瘤中的重要性越來(lái)越得到重視。本研究通過(guò)臨床篩查分析了研究人群的高危型HPV分布的特點(diǎn)，通過(guò)全基因組基因芯片分析HPV16/18陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞中顯著受E6/E7的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的微環(huán)境相關(guān)的細(xì)胞外分泌蛋白，其中分泌蛋白CTHRC1引起了我們的關(guān)注。本研究旨在分析CTHRC1在HPV16/18陽(yáng)性的宮頸組織的表達(dá)和宮頸癌細(xì)胞中的功能以探討

2、CTHRC1在HPV16/18陽(yáng)性宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制，以期CTHRC1成為一個(gè)新的宮頸癌診斷和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物以及宮頸癌治療的新靶點(diǎn)。
　　方法：(1)對(duì)1萬(wàn)名婦女進(jìn)行宮頸HPV分型檢測(cè)，確定受檢人群高危型HPV分布的特點(diǎn)及高危因素，分析研究人群中宮頸癌及癌前病變患者的高危型HPV分布特點(diǎn)。(2)利用RNA干擾技術(shù)，基因芯片技術(shù)及生物信息學(xué)分析技術(shù)分析宮頸癌細(xì)胞中顯著受HPV16/18 E6/E7調(diào)控的細(xì)胞外分泌蛋白，

3、并進(jìn)一步在宮頸癌數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)行驗(yàn)證。(3)用RT-PCR法比較HPV16/18陽(yáng)性的宮頸組織和HPV陰性的宮頸組織之間，HPV16/18陽(yáng)性的宮頸炎，CIN和宮頸癌組織之間CTHRC1的表達(dá)差異;用免疫組化法分析CTHRC1在宮頸癌，CIN和正常對(duì)照的差異，分析CTHRC1的表達(dá)與宮頸鱗癌臨床病理特征之間的關(guān)系。(4)構(gòu)建過(guò)表達(dá)和穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾慢病毒載體和純化的CTHRC1蛋白，分別檢測(cè)其對(duì)HPV16/18陽(yáng)性的宮頸癌細(xì)胞的增殖，侵襲，遷移

4、和化療抵抗的影響，利用CTHRC1單克隆抗體檢測(cè)其對(duì)純化蛋白處理宮頸癌細(xì)胞的遷移功能影響。(5)構(gòu)建熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)，檢測(cè)CTHRC1對(duì)宮頸癌Wnt經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路的影響，并利用磷酸化信號(hào)通路芯片檢測(cè)CTHRC1對(duì)Wnt經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路下游基因的影響。(6)用ELISA法檢測(cè)CTHRC1在HPV16/18陽(yáng)性的宮頸癌和癌前病變患者血清中的濃度，分析血清CTHRC1濃度評(píng)估宮頸癌的臨床診斷價(jià)值。
　　結(jié)果：(1)1萬(wàn)名婦

5、女中宮頸高危型HPV分布由高到低依次為HPV52、16、58、18和33，其中CIN及宮頸癌患者的HPV類(lèi)型也主要是HPV16，52和18。(2)HPV16/18陽(yáng)性的宮頸癌細(xì)胞中顯著受E6/E7的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的微環(huán)境相關(guān)的細(xì)胞外分泌蛋白前五位依次是GTF2I，INSL6，BIRC3，PTN，CTHRC1，其中CTHRC1與多種腫瘤的發(fā)展相關(guān)，我們進(jìn)一步驗(yàn)證了其與宮頸癌的相關(guān)性，確定其為研究的目的基因。(3)免疫組化染色的結(jié)果顯示，CTHR

6、C1在宮頸鱗癌和宮頸腺癌組織中的高表達(dá)率分別為50.49％和68.96％，明顯高于正常組織（鱗狀上皮3.33％，腺上皮6.67％）及CIN組織21.0％的高表達(dá)率(P＜0.0001，P＜0.0001，0.0181);
　　在宮頸鱗癌組織中，CTHRC1的表達(dá)與腫瘤的臨床分期(p=0.0021)、腫瘤細(xì)胞的級(jí)別(p=0.0186)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.0075)，淋巴脈管浸潤(rùn)(p=0.0010)，腫瘤的直徑(P＜0.0001)和宮頸

7、基質(zhì)的浸潤(rùn)深度(p=0.0001)均顯著相關(guān)，隨著臨床分期的增加，腫瘤級(jí)別的升高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴脈管的浸潤(rùn)，腫瘤直徑＞4cm和宮頸基質(zhì)浸潤(rùn)深度＞1/2者，CTHRC1的高表達(dá)率顯著增加。(4)劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組比較，CTHRC1過(guò)表達(dá)細(xì)胞(HeLa和SiHa)及CTHRC1蛋白直接處理細(xì)胞均能明顯促進(jìn)細(xì)胞遷移，CTHRC1穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾細(xì)胞均能明顯抑制細(xì)胞遷移，差異均有顯著性（p值均＜0.01）?？沾┖湍z穿實(shí)驗(yàn)顯示，CTHRC1過(guò)表達(dá)

8、細(xì)胞穿出transwell小室細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組，差異有顯著性(p值均＜0.001)，CTHRC1穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾細(xì)胞穿出transwell小室數(shù)明顯少于對(duì)照組，差異有顯著性（p值均＜0.001）?？沾?shí)驗(yàn)還顯示，CTHRC1蛋白處理后細(xì)胞穿出transwell小室細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組，差異有顯著性（p值均＜0.001）。(5)抗CTHRC1單克隆抗體預(yù)處理SiHa細(xì)胞2min后，20nMCTHRC1重組蛋白再處理SiHa細(xì)胞并行空穿實(shí)驗(yàn)，結(jié)

9、果顯示穿出transwell小室的細(xì)胞數(shù)明顯減少(p＜0.001)，提示抗CTHRC1單克隆抗體能夠逆轉(zhuǎn)CTHRC1重組蛋白對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用。(6) MTT實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組比較，CTHRC1過(guò)表達(dá)HeLa細(xì)胞和穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾MS751對(duì)順鉑和紫杉醇的IC50值和細(xì)胞生存活力均無(wú)明顯影響，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p值均＞0.05); CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組比較，CTHRC1過(guò)表達(dá)細(xì)胞(HeLa和SiHa)及CTHRC1穩(wěn)轉(zhuǎn)干

10、擾細(xì)胞的增殖活性雖有變化，但均無(wú)顯著性差異（p值均＞0.05）;裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)顯示，過(guò)表達(dá)CTHRC1 HeLa組腫瘤平均體積及腫瘤重量大小分別為0.634±0.327(g)，0.340±0.21(cm3)，對(duì)照組腫瘤平均體積及腫瘤重量大小分別為0.226士0.160(g)，0.13±0.08(cm3)，兩組瘤體大小及重量相比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值分別為0.044和0.028。(7)在Wnt經(jīng)典通路報(bào)告系統(tǒng)中，與對(duì)照組比較，10nM，2

11、0nM CTHRC1蛋白處理Hela細(xì)胞組的TOP活性明顯降低，差異有顯著性（P值分別為0.023和0.0057），10nM，20nM蛋白處理SiHa細(xì)胞組TOP活性也明顯降低，差異有顯著性（P值分別為0.035和0.0068）;在Wnt非經(jīng)典通路報(bào)告系統(tǒng)中，與對(duì)照組比較，10nM，20nMCTHRC1蛋白處理Hela細(xì)胞組的ATF2活性明顯升高，差異有顯著性（P值分別為0.0083和0.0062），10nM，20nM蛋白處理SiHa細(xì)

12、胞組ATF2活性明顯升高，差異有顯著性（P值分別為0.0095和0.0056）。CTHRC1蛋白處理SiHa細(xì)胞，與對(duì)照組比較，30，120和720min時(shí)JNK磷酸化表達(dá)量均增加，GSK3α/β磷酸化均減少，差異均有顯著性（p值均＜0.05）。(8)不同人群的血清CTHRC1經(jīng) ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)健康人群組的血清CTHRC1平均濃度為3.21±1.70ng/ml(1.42到7.31 ng/ml)，CIN組的CTHRC1平均濃度為4.7

13、0±3.12ng/ml(1.26到14.15ng/ml)，宮頸癌患者的CTHRC1平均濃度為7.32±3.51 ng/ml(2.97-16.44ng/ml)。健康人及CIN組與宮頸癌組比較，P值分別為p＜0.0001和0.00053，差異具有顯著性。10對(duì)宮頸癌患者術(shù)前術(shù)后血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示:宮頸癌患者術(shù)前血清CTHRC1平均濃度為10.36±2.70ng/ml這些宮頸癌患者術(shù)后血清CTHRC1平均濃度為4.21士1.78，兩組數(shù)據(jù)

14、比較P值為P＜0.0001，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;根據(jù)血清CTHRC1濃度繪制ROC曲線，結(jié)果顯示CTHRC1診斷宮頸癌的AUC為0.890±0.048，參考約登指數(shù)法(Youden's index)確定診斷臨界值為4.20ng/ml，此時(shí)CTHRC1診斷高危GIST的靈敏度為84％，特異度為80％。
　　結(jié)論：(1)宮頸高危型HPV16和18型陽(yáng)性的人群是本地區(qū)管理和研究的重點(diǎn)。(2) CTHRC1是宮頸癌微環(huán)境中受HPVE6/E