五個(gè)不同地區(qū)牦牛部分生產(chǎn)性能候選基因多態(tài)性的研究.pdf

1、本研究利用PCR-SSCP和PCR-RFLP技術(shù)，對(duì)新疆巴州牦牛、天祝白牦牛、甘南牦牛、青海環(huán)湖牦牛四個(gè)不同類(lèi)群及培育品種大通牦牛PRL、PRLR、GH、GHR、IGF-Ⅰ五個(gè)候選基因遺傳多態(tài)性進(jìn)行了測(cè)定，分析了等位基因頻率、基因型頻率、多態(tài)信息含量、雜合度和有效等位基因數(shù)等指標(biāo)，并運(yùn)用最小二乘法分析了所發(fā)現(xiàn)的基因多態(tài)位點(diǎn)與牦牛體尺、體重等生長(zhǎng)發(fā)育性狀的關(guān)系，初步探討了PRL、PRLR、GH、GHR、IGF-Ⅰ基因作為影響生長(zhǎng)發(fā)育性狀候

2、選基因的可能性，取得了如下研究結(jié)果： 1.利用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子-Ⅰ基因(IGf-Ⅰ)多態(tài)性研究表明： (1)首次在牦牛IGF-Ⅰ基因的第1內(nèi)含子發(fā)現(xiàn)PCR-SSCP多態(tài)，IGF-Ⅰ基因第1內(nèi)含子的PCR-SSCP多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果表明，該多態(tài)位點(diǎn)由一對(duì)等位基因A、B控制，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)在67bp處單堿基C的缺失，造成了該多態(tài)位點(diǎn)的出現(xiàn)。等位基因A(B)在大通牦牛、天祝白牦牛、甘南牦牛、青海環(huán)湖牦牛、新疆巴

3、州牦牛群體中的基因頻率分別為：0.9028(0.0972)、0.9234(0.0766)、0.8485(0.1515)、0.7929(0.2071)、0.9200(0.0800)，等位基因A為五個(gè)群體中的優(yōu)勢(shì)等位基因。 (2)IGF-Ⅰ基因第5外顯子的PCR-SSCP分析結(jié)果表明，品種間基因型分布存在顯著差異。在大通牦牛中檢測(cè)到了從、BB和AB三種基因型，而在其它群體中只發(fā)現(xiàn)從型，呈單態(tài)型，達(dá)到了純合狀態(tài)。經(jīng)克隆測(cè)序表明：該位點(diǎn)

4、的多態(tài)是由于在202bp處一個(gè)T→C的突變，導(dǎo)致等位基因A突變成等位基因B。 (3)對(duì)IGF-Ⅰ基因上2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)不同基因型與大通牦牛6月齡生長(zhǎng)發(fā)育性狀指標(biāo)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果表明，IGF-Ⅰ基因第Ⅰ內(nèi)含子AA基因型的體重、體斜長(zhǎng)顯著高于A(yíng)B、BB基因型(P<0.05)。 (4)IGF-Ⅰ基因的二個(gè)多態(tài)位點(diǎn)基因型與大通牦牛早期發(fā)育的分析表明，18月齡IGF-Ⅰ第5外顯子位點(diǎn)AA基因型的個(gè)體體高最小二乘均值(91.43cm

5、)，與BB型(80.00cm)差異顯著(P<0.05)。在牦牛的早期選育中，AA型個(gè)體可以作為選留的對(duì)象。 (5)六月齡大通牦牛群體體尺指標(biāo)與甘南牦牛和天祝白牦牛群體比較可以看出不論公牛群還是母牛群，大通牦牛的平均體重顯著大于甘南牦牛和天祝牦牛群體平均體重(P<0.05)：大通牦牛的平均體斜長(zhǎng)顯著比甘南牦牛和天祝白牦牛長(zhǎng)(P<0.05)，而胸圍相比大通牦牛略高于其它兩個(gè)群體但差異不顯著(P>0.05)。在這些體尺指標(biāo)上，大通牦牛

6、表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。 2.利用PCR-SSCP和PCR-RFLP技術(shù)對(duì)GH基因、GHR基因多態(tài)性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明： (1)GH基因第3外顯子在183bp處發(fā)生T-C突變，該多態(tài)位點(diǎn)由一對(duì)等位基因A、B控制，其中A為優(yōu)勢(shì)等位基因，AA為優(yōu)勢(shì)基因型。五個(gè)群體的哈代-溫伯格平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，青海大通牦牛、青海環(huán)湖牦牛、天祝白牦牛、甘南牦牛處于非平衡狀態(tài)。運(yùn)用最小二乘法對(duì)三個(gè)牦牛群體進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)GH基因第3外顯子對(duì)體重有顯著影

7、響 (P<0.05)，其中，最小二乘法得出的均值，AA型最大，AB型次之，最小的為BB型。另外，GH基因第3外顯子對(duì)體長(zhǎng)也有顯著影響(P<0.05)，其中AA型體長(zhǎng)最長(zhǎng)，AB型次之，BB型體長(zhǎng)最短。GH基因第3外顯子對(duì)體高、胸圍、管?chē)鸁o(wú)顯著性影響(P>0.05)。 (2)GH基因第5外顯子在64bp處發(fā)生A-C的突變。GH基因第5外顯子位點(diǎn)上，A1為優(yōu)勢(shì)等位基因，A1A1為優(yōu)勢(shì)等位基因型。五個(gè)品種進(jìn)行的哈代-溫伯格平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯

8、示，甘南牦牛處于非平衡狀態(tài)；運(yùn)用最小二乘法對(duì)五個(gè)牦牛品種進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)第5外顯子對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。 (3)經(jīng)過(guò)PCR-SSCP分析，GH基因保守區(qū)位點(diǎn)呈單態(tài)性，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)多態(tài)性信息。 (4)經(jīng)過(guò)PCR-RFLP分析，特異性GH-I R引物對(duì)牦牛基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條長(zhǎng)約1244bp的產(chǎn)物，用限制性?xún)?nèi)切酶AvaⅠ、HaeⅢ、HinfⅠ、PstⅠ、SmaⅠ進(jìn)行酶切，AvaⅠ、HinfⅠ、HaeⅢ、

9、PstⅠ均具有預(yù)期的酶切位點(diǎn)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)多態(tài)性，而SmaⅠ不具有預(yù)期的酶切位點(diǎn)，經(jīng)測(cè)序比較，發(fā)現(xiàn)在878位點(diǎn)處的Sma I酶切位點(diǎn)“CCClGGG”丟失。 特異性GH-2R引物對(duì)牦?；蚪M進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度約為1037bp的DNA片段。采用限制性?xún)?nèi)切酶HinfⅠ、SmaⅠ、PstⅠ對(duì)該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行單酶酶切，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HinfⅠ、SmaⅠ、PstⅠ均具有酶切位點(diǎn)，且電泳檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期相一致，不具有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。而GH-

10、2R在限制性?xún)?nèi)切酶HaeⅢ的切點(diǎn)中，電泳檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期不一致，經(jīng)測(cè)序比較，發(fā)現(xiàn)在75位點(diǎn)處的酶切位點(diǎn)“CClGG”丟失。 3.利用PER-SSCP技術(shù)對(duì)PRL、PRLR基因多態(tài)性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明： 催乳素受體基因的第2外顯子、第3外顯子在大通牦牛、甘南牦牛、天祝白牦牛、青海環(huán)湖牦牛、新疆巴州牦牛5個(gè)品種中檢測(cè)到了AA、AB和BB基因型，而且在PRLR-exon2中A等位基因?yàn)?個(gè)牦牛群體的優(yōu)勢(shì)等位基因，具有較高的基因

11、頻率；在PRLR-exon3中，B等位基因較A基因占優(yōu)勢(shì)。PRLR-exon2在大通牦牛、新疆牦牛、天祝白牦牛、青海環(huán)湖牦牛、甘南牦牛A基因頻率都超過(guò)了0.500，分別為0.520、0.560、0.600、0.580和0.640?；蚨鄳B(tài)信息表現(xiàn)為中度多態(tài)。測(cè)序表明催乳素受體基因第二外顯子在174bp處的突變，為A→G，表現(xiàn)多態(tài)性。PRLR-exon3，在大通牦牛、天祝白牦牛、甘南牦牛、青海環(huán)湖牦牛、新疆牦牛五個(gè)群體中都檢測(cè)出從、BB、

12、AB三個(gè)基因型，而且B等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因。PRLR-exon3的PCR-SSCP結(jié)果及測(cè)序結(jié)果分析顯示該位點(diǎn)的98bp處多態(tài)為C→G取代造成。等位基因A(B)在大通牦牛，天祝白牦牛、甘南牦牛、青環(huán)湖原牦牛、新疆巴州牦牛的基因頻率分別為：0.460(0.540)、0.420(0.580)、0.500(0.500)、0.460(0.540)、0.450(0.550)。在PRLR-exon3中，除了在天祝白牦牛中表現(xiàn)為高度多態(tài)，其余牦牛品