北京地區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中綠膿桿菌耐藥分析及PFGE和MLVA分型方法比較.pdf

1、目的：
　　了解北京地區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中綠膿桿菌分離株的耐藥情況、基因型分布和菌株間的同源性,對(duì)綠膿桿菌感染進(jìn)行溯源和流行病學(xué)分析,為綠膿桿菌耐藥機(jī)制的研究提供依據(jù)和菌種資源。比較脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)和多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)兩種分型方法的優(yōu)劣。為綠膿桿菌的研究提供北京地區(qū)的分型數(shù)據(jù)。進(jìn)而為綠膿桿菌感染控制提供依據(jù),同時(shí)保障實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量和相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。
　　方法：
　　(1)收集2007年～

2、2011年北京地區(qū)17家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)和使用單位的綠膿桿菌分離株,使用法國梅里埃API20E細(xì)菌鑒定試紙條生化試驗(yàn)及16SrRNA序列擴(kuò)增和測(cè)序進(jìn)行綠膿桿菌菌株的鑒定;
　　(2)根據(jù)美國臨床與實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)和推薦方法,選擇青霉素類哌拉西林(Piperacillin,PIP)、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合物哌拉西林/他巴唑坦(Piperacillin-tazobactam,PIP-TAZ)、頭孢菌素類頭孢他啶(Cefta

3、zidime,CAZ)和頭孢噻肟(Cefotaxime,CTX)、氨基糖苷類慶大霉素(Gentamicin,GEN)、喹諾酮類環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)、碳青霉素烯類亞胺培南(Imipenem,IMP)、多肽類多粘菌素E(Colistin,Coli)7類8種抗生素,采用瓊脂稀釋法收集的134株綠膿桿菌分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn);通過IMP-EDTA協(xié)同實(shí)驗(yàn)和外膜蛋白OprD編碼基因的擴(kuò)增測(cè)序,對(duì)耐亞胺培南菌株進(jìn)行耐藥機(jī)制分析

4、;
　　(3)采用美國疾病預(yù)防控制中心推薦的脈沖場(chǎng)電泳方法(PFGE),經(jīng)SpeI限制性內(nèi)切酶酶切后的PFGE指紋圖譜用Bionumerics軟件進(jìn)行處理和聚類分析;
　　(4)采用串聯(lián)重復(fù)可變序列分析(MLVA)方法對(duì)134株綠膿桿菌進(jìn)行基因分型,經(jīng)13個(gè)VNTR位點(diǎn)的擴(kuò)增,利用Bioculator計(jì)算出各菌株的每個(gè)位點(diǎn)的重復(fù)序列數(shù)目,用Bionumerics軟件對(duì)重復(fù)序列的多態(tài)性特征數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和聚類分析,并與PFGE分

5、型結(jié)果相比較;
　　結(jié)果：
　　(1)經(jīng)過API20E生化鑒定結(jié)果軟件分析,從2988只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和55份飲水樣品中分離的135株疑似綠膿桿菌分離株,除PA73被鑒定為木糖氧化無色桿菌外,其余所有受試菌株的生化結(jié)果共產(chǎn)生了21種生化譜,第一鑒定結(jié)果均為綠膿桿菌,CMCC10110的API20E生化譜為220200463。其中PA001、PA002、PA060和PA075的鑒定ID％分別為25.2%、25.2%、57.7%和36

6、.9%,其他菌株ID%在98.9～99.9之間,T指數(shù)在0.5～1之間。鑒定確認(rèn)了134株為綠膿桿菌。
　　(2)134株實(shí)驗(yàn)動(dòng)物綠膿桿菌分離株經(jīng)瓊脂稀釋法藥敏試驗(yàn),結(jié)果存在對(duì)CTX,IMP,Coli,GEN,CIP五種抗生素不同程度的耐藥,其中對(duì)CTX的耐藥率為11.9%;對(duì)IMP的耐藥率為1.5%;對(duì)Coli的耐藥率為2.2%;對(duì)GEN的耐藥率為41%;對(duì)CIP的耐藥率為1.5%;對(duì)PIP、PIP-TAZ和CAZ均敏感。存在C

7、TX-Coli-GEN-CIP(n=1)和CTX-Coli-CIP(n=1)多重耐藥株和CTX-GEN(n=11)雙重耐藥。所有耐藥菌株均分離自北京市豐臺(tái)區(qū)。對(duì)2株亞胺培南耐藥株的耐藥機(jī)制分析表明外膜蛋白OprD編碼基因的變異是導(dǎo)致對(duì)亞胺培南耐藥的主要原因。
　　(3)134株綠膿桿菌分離株經(jīng)SpeI限制性內(nèi)切酶酶切后的PFGE指紋圖譜用Bionumerics軟件進(jìn)行處理和聚類分析,所有菌株被切出15～20條DNA片段,大小在20

8、Kb～1200Kb之間。共被分為了22個(gè)基因簇(A～V),108個(gè)基因型,分辨力指數(shù)D=0.955。優(yōu)勢(shì)簇為J、M、N和U,分別占39/134(29.1%)、15/134(11.2%)、22/134(16.4%)和13/134(9.7%)。各分離地之間的綠膿桿菌大部分為散發(fā)感染,個(gè)別不同來源菌株具有較高的基因相似度。
　　(4)MLVA所有菌株共被分為32個(gè)基因簇,51個(gè)基因型,分辨力指數(shù)D=0.763,低于PFGE方法。其中12

9、簇的菌數(shù)最多,占到了56.7%,其次是21簇,占14.2%?；蚍中徒Y(jié)果與MLVA數(shù)據(jù)庫比對(duì),各有1株菌與利比亞的和西班牙的分離株有較高同源性。
　　(5)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中綠膿桿菌感染呈現(xiàn)散在分布,來源和時(shí)間不同,基因型也隨之不同。PFGE與MLVA兩方法對(duì)IMP、Coli、CIP和GEN耐藥株的分型能力相同,PFGE對(duì)CTX耐藥菌株的分型能力略優(yōu)于MLVA。
　　結(jié)論：
　　北京地區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物綠膿桿菌存在亞胺培南、頭孢噻肟、

10、慶大霉素、環(huán)丙沙星和多粘菌素E的耐藥菌株,對(duì)慶大霉素和頭孢噻肟的耐藥率較高。亞胺培南耐藥株的耐藥機(jī)制是由于外膜蛋白OprD編碼基因的變異所引起。藥敏結(jié)果表明大部分菌株對(duì)抗生素仍然較敏感,是研究綠膿桿菌耐藥機(jī)制的良好資源。PFGE與MLVA方法對(duì)受試菌株均能有效分型,顯示北京地區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中綠膿桿菌的基因型比較豐富,感染源較多,且不同分離地存在基因高相似度的分離株。同一分離地的PA分離株隨時(shí)間不同表現(xiàn)出不同的基因型,表明存在不同的感染源或變