綠膿桿菌外毒素A(PEA)入侵細(xì)胞的定時(shí)定量探究.pdf

1、綠膿桿菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A,PEA)是一種細(xì)菌性蛋白質(zhì)毒素,由銅綠假單胞菌屬綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)分泌。PEA可將真核細(xì)胞內(nèi)蛋合成白質(zhì)的關(guān)鍵延長(zhǎng)因子EF-2核糖基化并使其失活,從而使蛋白質(zhì)的合成受到抑制,最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。此前的很多研究集中在PEA毒素催化反應(yīng)階段,對(duì)前期的與細(xì)胞膜受體結(jié)合和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)路徑的相關(guān)研究較少。
　　為追蹤綠膿桿菌外毒素A進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的時(shí)

2、間和效率,我們構(gòu)建四種熒光蛋白標(biāo)記和兩種海腎熒光素酶標(biāo)記的綠膿桿菌外毒素A的融合毒素,來探究毒素進(jìn)入細(xì)胞的量與時(shí)間的關(guān)系,以及毒素進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的路徑。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)加毒素蛋白1小時(shí)后,進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的總毒素量占結(jié)合細(xì)胞表面總毒素量的14.75％;其中整個(gè)毒素片段占11%;酶切后的毒素片段占3.72%。;2小時(shí)后達(dá)到最大值,之后隨著培養(yǎng)時(shí)間的降低有所降低,但降低量并不太大。加入nocodazole后細(xì)胞質(zhì)中總毒素量有所降低,加入monesin或N

3、H4Cl后,進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中的整個(gè)毒素蛋白分子的量被抑制50%,酶切后的毒素C片段量明顯被完全抑制。
　　為研究綠膿桿菌外毒素A在細(xì)胞內(nèi)的裂解和酶切效率,我們運(yùn)用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescent resonance energy transferring,FRET)的方法設(shè)計(jì)了具有兩個(gè)熒光標(biāo)簽的PEA融合毒素,如RPG(DsRed2-PE44-eGFP)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)毒素以脈沖形式進(jìn)入細(xì)胞半小時(shí)后,供體熒光量開始升高,說明部分毒素