輔助生育技術(shù)出生子代的基因組學(xué)研究.pdf

1、研究背景：體外受精-胚胎移植技術(shù)開(kāi)展至今已30年，到目前為止全世界范圍內(nèi)已出生輔助生育技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)子代約3,000,000，這些子代代表了人口的一個(gè)重要組成部分。已有報(bào)道提示在ART子代中健康風(fēng)險(xiǎn)增加，包括自然流產(chǎn)，低體重、極低體重、小于胎齡兒、出生缺陷、腦癱等，原因尚不明確。ART子代基因組表達(dá)的整體狀況如何，與自然受孕子代的基因組表達(dá)譜有無(wú)差別，有多大差別，其表達(dá)改

2、變主要源自于基因序列變化抑或表觀遺傳修飾的變化，受影響的基因主要包括哪些，目前皆缺少相關(guān)研究和評(píng)估。該狀況明顯滯后于人們對(duì)ART安全性問(wèn)題日益增長(zhǎng)的關(guān)注程度，也將會(huì)明顯影響ART在人類(lèi)生殖健康方面應(yīng)有作用的充分發(fā)揮和完善，因此對(duì)ART子代安全性進(jìn)行系統(tǒng)性研究，深入探究健康高風(fēng)險(xiǎn)原因迫在眉睫。 近年來(lái)印跡缺陷，包括Beckwith-Wiedemann綜合征(Beckwith-Wiedemannsyndrome，BWS)、Angel

3、man綜合征(Angelman syndrome，AS)引起了人們的廣泛關(guān)注。多項(xiàng)病例對(duì)照研究提示在ART子代中印跡缺陷風(fēng)險(xiǎn)增加。印跡基因等位基因特異性表達(dá)的破壞與人類(lèi)遺傳疾病、某些腫瘤及神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)，其親緣特異性表達(dá)需要正常水平的DNA甲基化，印跡基因的甲基化在配子發(fā)生過(guò)程中擦除并重新建立，在種植前后維持甲基化，而ART技術(shù)在配子發(fā)生、受精及種植前后階段操作配子和胚胎，這一時(shí)期恰恰是印跡基因甲基化重新編程的關(guān)鍵時(shí)期，因此可能導(dǎo)致印

4、跡基因甲基化異常。 目前ART操作與印跡基因印跡狀態(tài)的關(guān)系尚未明確。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示操作及體外培養(yǎng)胚胎可能破壞基因組印跡，而且在配子形成過(guò)程中發(fā)生的表觀遺傳改變?cè)诜N植后發(fā)育過(guò)程中不能糾正，可能與印跡基因表達(dá)異常及表型異常相關(guān)。但是，人類(lèi)研究未發(fā)現(xiàn)可檢測(cè)的印跡基因表達(dá)異常，提示配子形成過(guò)程中建立的印跡在ART過(guò)程中穩(wěn)定保持。目前可獲得的有關(guān)ART與基因印跡疾病相關(guān)性的人類(lèi)研究信息多來(lái)自ART子代出生后單個(gè)或幾個(gè)印跡基因檢測(cè)的報(bào)道，缺少

5、大樣本ART子代基因組印跡整體狀況及其改變的研究資料，有必要對(duì)ART子代印跡狀態(tài)進(jìn)行系統(tǒng)性研究。 本研究首先通過(guò)染色體核型和微缺失檢測(cè)評(píng)估ART子代基因突變的風(fēng)險(xiǎn)。然后通過(guò)affymetrix全基因組表達(dá)芯片及熒光定量PCR進(jìn)行全基因組表達(dá)譜和印跡基因的mRNA總表達(dá)水平的檢測(cè)以評(píng)估ART子代mRNA表達(dá)異常的風(fēng)險(xiǎn)。并進(jìn)一步以ART子代中表達(dá)異常的印跡基因作為候選基因，檢測(cè)候選基因的單等位表達(dá)，研究DNA．甲基化與印跡穩(wěn)定性的關(guān)

6、系。從而在基因序列、基因表達(dá)及表觀遺傳修飾三個(gè)層面全面、系統(tǒng)地評(píng)估ART子代基因組學(xué)安全性。 第一部分：輔助生育技術(shù)出生子代基因突變的檢測(cè) 目的：研究無(wú)遺傳學(xué)高風(fēng)險(xiǎn)的ART男性子代中染色體異常和Y染色體微缺失發(fā)生情況，從而反映ART子代發(fā)生基因突變的風(fēng)險(xiǎn)。 材料與方法：收集我院出生的ART男性子代臍血37例，包括19例IVF子代及18例ICSI子代，以同期在我院分娩的60例自然妊娠男性子代為對(duì)照，采集臍血行染色體

7、核型分析和Y染色體微缺失檢測(cè)，并對(duì)其父代進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)，數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果：自然妊娠子代及ART子代中均未發(fā)現(xiàn)染色體核型異常。37例ART子代中發(fā)現(xiàn)4例(10.8％)Y染色體微缺失，其中19例IVF子代中1例(5.3％)，18例ICSI子代中3例(16.7％)，ART子代中微缺失發(fā)生率顯著高于自然妊娠子代，P<0.05。微缺失子代的父代均未發(fā)現(xiàn)微缺失.1例存在Y染色體微缺失的ART子代合并尿道下裂。 結(jié)論：父代遺傳學(xué)背景

8、正常的ART男性子代Y染色體de novo微缺失風(fēng)險(xiǎn)較自然妊娠子代顯著增高，提示ART子代中基因突變的風(fēng)險(xiǎn)較自然妊娠子代中增加，可能與ART技術(shù)相關(guān)，需密切關(guān)注ART子代遺傳學(xué)安全性，進(jìn)一步深入研究其機(jī)制及影響面，采取適當(dāng)措施控制其發(fā)生。 第二部分：輔助生育技術(shù)子代全基因組表達(dá)譜及印跡基因表達(dá)狀況 目的：研究ART子代中基因表達(dá)譜與自然妊娠子代是否存在差異，闡明其差異程度及主要方面，同時(shí)分析ART子代中印跡基因的表達(dá)差異

9、，并篩選關(guān)鍵性的差異基因。 材料與方法：應(yīng)用Affymetrix公司的Human GenomeUl33 Plus 2.0芯片，對(duì)ART子代和自然妊娠子代各8例進(jìn)行檢測(cè)，利用芯片顯著性分析(significance analysisof microarray,SAM)比較兩組標(biāo)本基因表達(dá)，采用分層聚類(lèi)、GO(gene ontology)分類(lèi)及信號(hào)通路(Pathway)分析對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行數(shù)據(jù)分析．收集我院出生的ART子代及自然妊

10、娠子代臍血各40例，對(duì)關(guān)鍵性差異表達(dá)基因及可能存在表達(dá)差異的印跡基因行熒光定量RT-PCR檢測(cè)。 結(jié)果：采用SAM法得到兩組間差異最為顯著的159個(gè)基因，對(duì)差異基因進(jìn)行無(wú)監(jiān)督的分層聚類(lèi)，可完全區(qū)分ART子代和自然妊娠子代．GO分析顯示差異基因中包括與生長(zhǎng)和發(fā)育相關(guān)的基因。Pathway分析發(fā)現(xiàn)8條信號(hào)通路差異變化有顯著性，包括Toll樣受體信號(hào)通路等。熒光定量PCR檢測(cè)8個(gè)非印跡基因和9個(gè)印跡基因在ART子代和自然妊娠子代中的表

11、達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)6個(gè)非印跡基因和3個(gè)印跡基因的表達(dá)在兩組間存在顯著性差異。 結(jié)論：部分基因在ART子代中表達(dá)改變，其中與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因在ART子代中表達(dá)降低，可能為ART子代低體重的一個(gè)機(jī)制。ART子代中印跡基因總的表達(dá)狀況與自然妊娠子代相似，僅3個(gè)印跡基因在ART子代中表達(dá)改變，即PEGlO和L3MBTL表達(dá)上調(diào)，PHLDA2表達(dá)下調(diào)。 第三部分：輔助生育技術(shù)出生子代印跡基因PEG10、L3MBTL及PHLDA2的印跡

12、狀況 目的：研究ART子代臍血中PEG10、L3MBTL及PHLDA2的等位基因表達(dá)狀況，探討ART子代中印跡狀態(tài)異常的風(fēng)險(xiǎn)。 材料與方法：以60例ART子代為研究組，20例自然妊娠子代為對(duì)照，采用PCR直接測(cè)序及RT—PCR直接測(cè)序?qū)EG10、L3MBTL及PHLDA2的等位基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果：在自然妊娠子代中未發(fā)現(xiàn)印跡丟失情況。在ART子代中存在印跡丟失，其中，7例ART子代中存在PEG10基因印跡丟

13、失，發(fā)生率為31.8％(7/22)，1例ART子代中存在L3MBTL基因印跡丟失，發(fā)生率為5.56％(1/18)。PHLDA2基因在ART子代及自然妊娠子代臍血中均為雙表達(dá)。 結(jié)論：小部分ART子代臍血中印跡基因PEG10和L3MBTL的單等位表達(dá)被破壞，提示ART子代中印跡狀態(tài)的不穩(wěn)定性。 第四部分：輔助生育技術(shù)出生子代印跡基因PEG10及L3MBTL的甲基化狀況 目的：研究ART子代中印跡基因PEG10和L3

14、MBTL CpG島的甲基化狀況，評(píng)估ART子代中甲基化異常的風(fēng)險(xiǎn)，探索印跡丟失與CpG島甲基化的關(guān)系。 材料與方法：以4例ART子代和2例自然妊娠子代為研究對(duì)象，采用亞硫酸氫鹽測(cè)序的方法檢PEG10和L3MBTL的CpG島的甲基化狀態(tài)。 結(jié)果：在自然妊娠子代及ART子代中PEGl0啟動(dòng)子區(qū)的22個(gè)CpG位點(diǎn)基本未發(fā)生甲基化，兩組標(biāo)本問(wèn)PEG10的甲基化狀況相似。L3MBTL基因在自然妊娠子代中所有CpG位點(diǎn)均為中等甲基化