Apelin對(duì)心肌缺血大鼠心臟側(cè)枝循環(huán)的影響和機(jī)制.pdf

1、心肌梗死是威脅人類健康的重要心血管疾病之一,是引起猝死和心力衰竭的主要因?yàn)?所以有必要進(jìn)行積極有效的再灌注治療,以挽救瀕死心肌。再灌注的形式,包括心血管介入治療,冠狀動(dòng)脈搭橋,干細(xì)胞移植等,其中心臟的側(cè)枝循環(huán)形成對(duì)于防止心肌梗死,心功能的保護(hù)具有重要意義。
　　 Apelin是1998年日本學(xué)者Tatemoto從牛胃組織提取物中分離出一種小分子多肽,是血管緊張素受體AT1相關(guān)受體蛋白(Angiotension Ⅱ Protein

2、 J,APJ)的內(nèi)源性配體,Apelin/APJ信號(hào)通路可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路的激活產(chǎn)生多種生理功能。Apelin在心血管系統(tǒng)高度表達(dá),它具有增強(qiáng)心肌收縮力、擴(kuò)張血管、減輕心臟負(fù)荷、促進(jìn)血管生長、調(diào)節(jié)水鹽平衡等作用,其中Apelin促進(jìn)血管形成的作用,越來越引起學(xué)者的重視。
　　 Apelin信號(hào)對(duì)心臟和血管的形成有重要作用。它在視網(wǎng)膜血管的內(nèi)皮層中也高度表達(dá),Apelin足一個(gè)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成因子。與許多其它的血管

3、生成因子相似,在低氧的情況下,Apelin基因的表達(dá)是增加的。用反義技術(shù)抑制Apelin的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致血管生成障礙,Apelin具有促有絲分裂、促進(jìn)分化和抑制凋亡的作用。另外,Apelin及其受體Agtrlb還控制斑馬魚原腸時(shí)期心臟形態(tài)的發(fā)生,Apelin和Agtrllb受體表達(dá)不足或者表達(dá)過度都將導(dǎo)致心臟前體缺陷并最終祟及心臟發(fā)育。另外,Apelin會(huì)加速血管生成開關(guān)的打開,潛在的激活了腫瘤的新生血管形成。Apelin基因在三分之一的人

4、類腫瘤中表達(dá)上調(diào)。Apelin促進(jìn)新生血管的特性,已經(jīng)在小鼠的腫瘤新生血管形成過程中得到證實(shí)。
　　 Apelin對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的促有絲分裂和血管生成的特性意味著它也許在治療與血管生成有關(guān)的疾病方面有潛在的作用。APJ的受體激動(dòng)劑或許能夠作為藥理學(xué)工具在血管形成對(duì)抗缺血性疾病方面有治療意義,而它的拈抗劑或許能夠阻止血管形成,以阻止腫瘤生長和缺血性視網(wǎng)膜病。Apelin作為一個(gè)強(qiáng)有力的內(nèi)皮生長和血管生成的刺激因子,激活這種信號(hào)通路,能

5、否促進(jìn)缺血心肌的血管生成,減輕心肌缺血所致的損傷或者壞死,目前尚不得而知。
　　 本課題旨在通過觀察:Apelin是否參與和保護(hù)心肌缺血損傷及其機(jī)制；外源性給予Apelin能否促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,遷移和血管形成；外源性給予Apelin能否增加心肌細(xì)胞側(cè)支循環(huán)的形成,Apelin是通過那個(gè)通路促進(jìn)血管的形成的,從而為挽牧缺血、瀕死的心肌尋找一條有效的途徑。
　　 目的：
　　 1、建立在體大鼠心肌缺血模型,觀察心肌

6、缺血時(shí)Apelin足否對(duì)心臟有保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　 2、外源性給予Apelin能否促進(jìn)心臟側(cè)支循環(huán)的形成,減少心肌缺血或者心肌梗死。
　　 3、通過HUVECs了解Apelin對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖,遷移和血管形成的影響,以探討Apelin促進(jìn)血管形成的可能機(jī)制,以及這種機(jī)制是否與哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)。
　　 方法：
　　

7、1、Apelin對(duì)心肌缺血大鼠的心臟保護(hù)作用
　　 (1)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎,建立心肌缺血模型。腹腔注射Apelin(1μg/kg.d×2),應(yīng)用心導(dǎo)管檢查心率(HR)、左室最大收縮壓(LVESP)、左室舒張末期壓(LVEDP)、左室內(nèi)壓最大升降速度(±dP/dTmax)以評(píng)價(jià)Apelin對(duì)心功能的影響。
　　 (2)雄性SD大鼠冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎,建立心肌缺血模型,腹腔注射

8、Apelin(1μg/kg.d×2),抽血檢測(cè)血中乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)含量。
　　 2、Apelin對(duì)心肌缺血大鼠心臟側(cè)枝循環(huán)的影響
　　 (1)大鼠冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎,建立心肌缺血模型,同時(shí)給予Apelin腹腔注射(1μg/kg.d×7)以觀察Apelin對(duì)心臟側(cè)枝循環(huán)的影響。
　　 (2)酶聯(lián)免疫法(enzyme linked immunosorbent assay

9、,ELISA)測(cè)定大鼠心肌缺血損傷時(shí)血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1(PECAM1/CD31)蛋白含量。
　　 (3)伊文氏藍(lán)和紅四氮唑(TTC)雙染色,應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖象分析系統(tǒng)計(jì)算心肌梗死面積。
　　 (4)通過CD31免疫組化染色,在顯微鏡下觀察缺血心肌組縱的血管生成情況。
　　 (5)HE染色顯微鏡下觀察缺血心肌組織的損傷情況。
　　 (6)通過western blot檢測(cè)VEGF和CD31的表達(dá)。

10、　　 3、Apelin對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖,遷移和血管形成的影響
　　 (1)應(yīng)用甲基噻嘩皋四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)的方法觀察Apelin對(duì)HUVECs增殖的影響。
　　 (2)通過Transwell觀察Apelin對(duì)HUVECs遷移的影響。
　　 (3)應(yīng)用Tubeformation觀察Apelin對(duì)HUVECs血管形成的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1

11、、Apelin對(duì)心肌缺血大鼠心功能的保護(hù)作用與其它各組比較,大鼠心肌缺血48h時(shí)Apelin治療組(1μg/kg.d×2,腹腔注射)能明顯提高LV±dp/dtmax、LVESP,降低LVEDP(P<0.05、0.01)。
　　 2、Apelin對(duì)心肌缺血大鼠心肌酶的影響自動(dòng)生化儀結(jié)果顯示,大鼠心肌缺血48h時(shí)Apelin治療組(1μg/kg.d×2,腹腔注射)的LDH含量明顯較其它各組為低(P<0.01)。
　　 3、A

12、pelin對(duì)心肌缺血大鼠CD31表達(dá)的影響酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定大鼠心肌缺血大鼠的CD31結(jié)果顯示,Apelin治療組(1μg/kg.d×7,腹腔注射)的CD31含量明顯較其它各組為高(P<0.05)。
　　 4、伊文氏藍(lán)和紅四氮唑(TTC)雙染色,通過計(jì)算機(jī)圖象分析系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)心肌梗死面積結(jié)果發(fā)現(xiàn),Apelin治療組(1μg/kg.d×7,腹腔注射)的心肌梗塞面積明顯較其它各組為低(P<0.05)。
　　 5、Ape

13、lin對(duì)心肌缺血大鼠微血管密度的影響CD31免疫組化染色,顯微鏡下觀察心肌組織的微血管密度(MVD,microvessel density)發(fā)現(xiàn),Apelin治療組的MVD計(jì)數(shù)明顯較其它各組為多(P<0.01)。
　　 6、Apelin對(duì)心肌缺血大鼠心肌結(jié)構(gòu)的影響HE染色顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Apelin治療組的瘢痕形成較其它各組少。
　　 7、Apelin對(duì)心肌缺血大鼠VEGF和CD31表達(dá)的影響Western blot結(jié)果

14、顯示Apelin組(1μg/kg.d×7,腹腔注射)的VEGF和CD31蛋白表達(dá)明顯較其它各組為高。
　　 8、Apelin對(duì)HUVECs增殖的影響應(yīng)用MTT觀察Apelin對(duì)HUVECs增殖的影響發(fā)現(xiàn),與其它各組梢比Apelin(Apelin 1umol/L)可以明顯的促進(jìn)HUVECs的增值(P<0.01)。
　　 9、Apelin對(duì)HUVECs遷移的影響應(yīng)用Transwell觀察Apelin對(duì)HUVECs遷移的影響發(fā)

15、現(xiàn),與其它各組相比Apelin(Apelin 1μg/ml)可以明顯的促進(jìn)HUVECs的遷移(P<0.01)。
　　 10、Apelin對(duì)HUVECs血管形成的影響Tubeformation觀察Apelin對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞血管形成的影響發(fā)現(xiàn),Apelin(Apelin 60uM)治療組的小管形成的數(shù)目較其他各組為多(P<0.05)。
　　 11、盡管Apelin對(duì)缺血心肌和HUVECs有上述作用,但足在應(yīng)用了PLC的抑制劑U-

16、73122以后,Apelin的心肌保護(hù)和心功能保護(hù)作用消失；在應(yīng)用了mTOR的阻斷劑-雷帕霉素后,Apelin對(duì)心肌缺血側(cè)枝循環(huán)和對(duì)HUVECs促進(jìn)增殖、遷移和血管形成的作用消失,與對(duì)照組無明顯差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1、Apelin可以保護(hù)心肌缺血的心臟損傷和心功能。
　　 2、Apelin保護(hù)心肌缺血的心臟損傷和增強(qiáng)心肌收縮力可能與激活細(xì)胞內(nèi)的PLC信號(hào)通路有關(guān)。
　　 3、Apel