RNAi抑制小鼠樹突細(xì)胞共刺激通路的體外研究.pdf

1、目的：本課題應(yīng)用RNAi技術(shù)修飾小鼠骨髓來源樹突細(xì)胞（Dendritic Cell，DC），敲減DC表面共刺激分子B7-1（CD80）及B7-2（CD86）表達(dá)，探討RNAi對DC表面抗原CD80、CD86表達(dá)的影響以及誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞無能的機(jī)理。 方法：采用培養(yǎng)基細(xì)胞因子選擇法體外培養(yǎng)小鼠骨髓來源DC，利用已構(gòu)建的針對B7-1（CD80）及B7-2（CD86）的shRNA質(zhì)粒載體pB7shRNA轉(zhuǎn)染DC，流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染前后D

2、C表面抗原CD80、CD86、MHCⅡ、CD11c表達(dá)情況，混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)觀察pB7shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DC前后對激活異系T淋巴細(xì)胞增殖能力的影響，熒光實(shí)時定量PCR測定轉(zhuǎn)染前后CD80、CD86mRNA及混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系IL-2mRNA表達(dá)水平。使用SPSS15．0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 結(jié)果：經(jīng)過體外培養(yǎng)，每只小鼠可獲得1．5-2×107個骨髓來源DC，細(xì)胞具備典型樹突狀結(jié)構(gòu)，pB7shRNA質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染DC后經(jīng)流式細(xì)胞儀

3、檢測其表面抗原CD80、CD86表達(dá)變化由92．812±1．377％、70．510±1．947％分別下降至31．137±1．702％、40．511±1．555％，與對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比有顯著差異（P＝0．000）。而：MHCⅡ、CD11c表達(dá)無明顯變化。熒光實(shí)時定量PCR檢測pB7shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠骨髓源DC后，CD80、CD86mRNA表達(dá)水平下降至33．481±2．823％、37．431±2．218％，與對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比具有顯著

4、差異（P＝0．000）。混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)顯示，pB7shRNA干擾DC對異系T淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)下降，與對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比有顯著差異（P=0．000），反應(yīng)體系中IL-2mRNA表達(dá)水平下降至25．675±1．521％，與對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比具有顯著差異（P＝0．000）。 結(jié)論：培養(yǎng)基細(xì)胞因子選擇法可收獲大量的骨髓源DC。脂質(zhì)體介導(dǎo)pB7shRNA質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染小鼠骨髓DC可高效、特異地抑制B7-1及B7-2分子的表達(dá)，使DC激活