FPS-ZM1對糖基化終產(chǎn)物所致大鼠海馬區(qū)炎性反應(yīng)和Aβ異常代謝的影響與機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　阿爾茲海默病(AD)是一種起病隱匿且慢性進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以記憶力下降和認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)。如今AD已成為老年人癡呆最常見的病因，并隨著我國老齡化程度的加劇和日益增高的發(fā)病率，逐漸成為繼心血管病、腫瘤與腦卒中之后威脅老年人健康的第四大殺手，給社會和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)，因此如何遏制AD的發(fā)生發(fā)展成為亟待解決的問題。已知AD主要病理改變是細(xì)胞外老年斑沉積，細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)及腦內(nèi)慢性炎癥。β淀粉

2、樣蛋白(Beta amyloid protein，Aβ)是由β分泌酶(β secretion enzyme，BACE1)等水解淀粉樣前體蛋白(amyloid precusor protein，APP)而產(chǎn)生的一種非特異性結(jié)合蛋白。近年研究顯示，Aβ不僅能聚集參與AD特征性病理改變即老年斑的形成，而且在早期能與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)結(jié)合，激活相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)信號通路，進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)元毒性、氧化應(yīng)激與炎性等級聯(lián)反應(yīng)，成為各種原因誘發(fā)A

3、D的共同通路，參與不同階段的神經(jīng)損傷，最終導(dǎo)致記憶等認(rèn)知方面的下降。因此Aβ是AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素，減少Aβ的生成有希望成為阻斷AD進(jìn)程的有效手段。
　　糖基化終產(chǎn)物((advaneed glycation end products，AGEs)是蛋白質(zhì)的氨基與還原糖的羰基在無酶不可逆條件下形成的不溶性聚合物，高糖狀態(tài)及老齡人體內(nèi)AGEs增加。近年來有大量研究證據(jù)表明，AGEs參與糖尿病中（腎、腦、足、視網(wǎng)膜及骨等）各種靶器官的

4、損害。研究亦表明2型糖尿病是AD發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一，AD可能與糖尿病一樣，是一種內(nèi)分泌紊亂導(dǎo)致的代謝性疾病。Carvalh發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠皮層和海馬區(qū)Aβ明顯增多，并且在AD動(dòng)物模型中，早期老年斑周圍也均有AGEs表達(dá)，說明AGEs、糖尿病及AD三者之間有著密切的聯(lián)系。不僅如此，研究者發(fā)現(xiàn)隨著AD動(dòng)物模型病程的進(jìn)展，AGEs與Aβ均聚集逐漸增多，進(jìn)一步提示AGEs是導(dǎo)致AD病理改變的主要因素之一，且貫穿于AD病程始末。糖基化終產(chǎn)物受體(r

5、eceptor for advanced glycation endproducts，RAGE)是AGEs和Aβ的共同受體，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞膜上，在AD患者腦中高表達(dá)。RAGE能介導(dǎo)Aβ通過血腦屏障（blood brain barrier，BBB）加劇Aβ的聚集和神經(jīng)纖維的纏結(jié)，并通過與其配體AGEs或Aβ結(jié)合活化小膠質(zhì)細(xì)胞從而引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥因子正反饋上調(diào)RAGE的自身表達(dá)，形成惡性循環(huán)，使神經(jīng)損傷進(jìn)一步擴(kuò)大。目前已

6、有研究證實(shí)，RAGE與其配體AGEs結(jié)合引起的一系列反應(yīng)是導(dǎo)致糖尿病腦損害和AD發(fā)生血管病變及認(rèn)知障礙的共同通路，同時(shí)AGEs也在衰老中起重要作用。因此阻斷RAGE與AGEs的結(jié)合，可能會在很大程度上遏制上述疾病尤其是AD的進(jìn)展。上述研究提示RAGE可能是治療AD的有效靶點(diǎn)。當(dāng)前阻斷RAGE的手段主要有RAGE抗體及sRAGE，且體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)均取得一定效果，但由于二者皆不能通過BBB作用于腦內(nèi)的RAGE來干擾AGEs的代謝，因此迄今為止

7、仍無有效抑制RAGE的方法。此外，目前的治療AD藥物臨床療效并不十分理想。新近研發(fā)的RAGE阻斷劑(PF-04494700)在臨床前期實(shí)驗(yàn)的確能改善AD癥狀，但由于毒副作用太大而停用。因此，研發(fā)既能通過血腦屏障又安全高效的RAGE阻斷藥物，具有更重要的意義。FPS-ZM1是由Deane等首次人工合成的無毒性RAGE特異性阻斷劑。通過用FPS-ZM1干預(yù)APP轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)現(xiàn)，該藥能通過血腦屏障作用于腦內(nèi)RAGE，從而阻斷RAGE與Aβ的結(jié)

8、合引發(fā)的炎性反應(yīng)，并能阻斷外周Aβ與血腦屏障上的RAGE結(jié)合進(jìn)入中樞，因此該藥可能成為理想的阻斷RAGE的新藥物。
　　已知AGEs-RAGE是參與AD發(fā)生發(fā)展的重要因素，F(xiàn)PS-ZM1對RAGE介導(dǎo)的多條損傷通路有較強(qiáng)的抑制作用。已有研究證明FPS-ZM1對APP轉(zhuǎn)基因AD模型有明顯神經(jīng)保護(hù)作用，然而，F(xiàn)PS-ZM1是否對AGEs誘導(dǎo)的腦神經(jīng)損傷有保護(hù)作用未見報(bào)道。因此，我們設(shè)計(jì)該課題，通過建立AGEs腦損傷動(dòng)物模型，進(jìn)一步研究

9、AGEs-RAGE通路的腦損傷機(jī)制及FPS-ZM1阻斷RAGE的腦保護(hù)效果和可能機(jī)制。
　　目的：
　　(1)明確AGEs損傷機(jī)制，探討不同損傷通路之間可能的聯(lián)系。
　　(2)探討FPS-ZM1對AGEs腦損傷所致海馬區(qū)Aβ異常代謝的影響。
　　(3)探討FPS-ZM1對AGEs腦損傷所致海馬區(qū)炎性反應(yīng)的作用機(jī)制。
　　研究方法：
　　(1)建立AGEs腦損傷模型，大鼠麻醉后固定于立體定位儀上，常規(guī)備

10、皮消毒，于顱頂部正中切開皮膚。參考Miguel-Hidalg等的方法，用微量注射泵海馬注射法，兩側(cè)海馬內(nèi)注射AGEs各5μl，建立AGEs腦損傷模型。
　　(2)分組及造模:將40只大鼠隨機(jī)分4組（每組各10只）:
　　a.生理鹽水組(NC組):海馬內(nèi)注射生理鹽水。
　　b.FPS-ZM1對照組:海馬內(nèi)注射生理鹽水。
　　c.AGEs組:海馬內(nèi)注射AGEs。
　　d.FPS-ZM1組:海馬內(nèi)注射AGEs。<

11、br>　　(3)干預(yù)方法:FPS-ZM1組和FPS-ZM1對照組:造模前1周以1mg/kg/d注射FPS-ZM1，并連續(xù)4周給藥;AGEs組、NC組:腹腔注射相同體積生理鹽水。
　　(4)觀察指標(biāo)及檢測方法:造模3周后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，在測試期記錄每次找到平臺的時(shí)間(escape latency，EL)。水迷宮測試完成后，用免疫組化檢測各組大鼠海馬TNFα的蛋白表達(dá)，通過Western blot半定量檢測各組大鼠海馬區(qū)R

12、AGE,β分泌酶、APP、CD11b，p-NF-κB和TNFα的表達(dá)，用ELISA法定量檢測各組大鼠海馬區(qū)Aβ1-40，Aβ1-42的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　(1)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)
　　AGEs組逃避潛伏期較NC組、FPS-ZM1對照組明顯延長(P＜0.01)，F(xiàn)PS-ZM1組逃避潛伏期較AGEs組明顯縮短(P＜0.01)，F(xiàn)PS-ZM1組逃避潛伏期較NC組、FPS-ZM1對照組無明顯改變(P＞0.05)。

13、>　　(2)免疫組化檢測大鼠海馬區(qū)TNFα的表達(dá)
　　與其他各組比較，AGEs組大鼠海馬組織可見TNFα蛋白呈棕褐色陽性表達(dá)，著色最深;FPS—ZM1組免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)少，染色淺;NC組、FPS—ZM1對照組海馬區(qū)幾乎沒有陽性表達(dá)，且較AGEs組和FPS—ZM1組細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞無明顯萎縮現(xiàn)象。
　　(3)Western blot半定量檢測各組大鼠海馬區(qū)RAGE、CD11b，pNF-κB、TNFα和β分泌酶、APP的表達(dá)

14、
　　AGEs組RAGE、CD11b，pNF-κB、TNFα和β分泌酶、APP的表達(dá)明顯高于NC組、FPS-ZM1對照組(P＜0.01);與AGEs組比較，F(xiàn)PS-ZM1組上述指標(biāo)表達(dá)明顯降低(P＜0.01);與NC組、FPS-ZM1對照組比較，F(xiàn)PS-ZM1組RAGE表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)，但除RAGE外其他指標(biāo)表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.01)。
　　(4)用Elisa檢測各組大鼠海馬區(qū)Aβ1-40，Aβ1-42
　

15、　AGEs組海馬區(qū)Aβ1-40和Aβ1-42的濃度均較NC組、FPS-ZM1對照組明顯增高(P＜0.01);與AGEs組，F(xiàn)PS-ZM1組Aβ1-40和Aβ1-42的濃度明顯降低(P＜0.01)，與NC組、FPS-ZM1對照組比較，F(xiàn)PS-ZM1組Aβ1-40和Aβ1-42的濃度升高(P＜0.01)
　　結(jié)論：
　　(1)AGEs能通過誘導(dǎo)海馬區(qū)糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)的高表達(dá)，上調(diào)p-NF-κB并可能激活BACE1，

16、促進(jìn)Aβ1-40，Aβ1-42生成增加。
　　(2)RAGE受體阻斷劑FPS-ZM1能通過阻斷細(xì)胞上RAGE，減少腦組織NF-κB的激活，從而減輕腦AGEs損傷引起的炎性反應(yīng)。
　　(3)FPS-ZM1可能通過抑制細(xì)胞上RAGE，下調(diào)p-NF-κB，進(jìn)而降低BACE1的活性和APP蛋白水平，最終減少Aβ1-40，Aβ1-42生成，改善AGEs腦損傷大鼠的認(rèn)知水平。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)FPS-ZM1能減少Aβ生成并有抗炎作用，提示其腦保

17、護(hù)的多效性，為今后該藥的防治AD提供有利理論依據(jù)。該藥可能將成為抑制阿爾茨海默病的有效措施。
　　意義：
　　本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用腦立體定位技術(shù)建立大鼠AGEs海馬損傷模型，證實(shí)AGEs-RAGE通路能通過上調(diào)p-NF-κB并激活BACE1，促進(jìn)Aβ生成增加，且RAGE阻斷劑FPS-ZM1能抑制AGEs模型組海馬區(qū)Aβ生成及炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)AGE-RAGE通路是參與AD發(fā)生發(fā)展的重要因素，驗(yàn)證了RAGE是治療AD的有效靶點(diǎn)，F(xiàn)