生物法生產(chǎn)新型抗氧化劑2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸的研究.pdf

1、本論文建立了高效液相色譜法檢測2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸的方法。該方法色譜條件為：Agilent Zorbax SB-Aq色譜柱（5μm，4.6mm×150 mm）；流動(dòng)相為含0.08％三氟乙酸的水溶液；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測器為DAD檢測器，檢測波長236 nm；進(jìn)樣量：20μL。 在日本學(xué)者研究的基礎(chǔ)上有效簡化分離純化步驟，粉碎枸杞干果，浸提后采用FPLC提取到純度較高的AA-2βG。FP

2、LC條件如下：色譜柱：HiPrepTM16/10 QXL；流動(dòng)相：5％醋酸；流速u：5.0 mL/min；上樣量：10 mL/次；紫外檢測波長λ：254nm。 實(shí)驗(yàn)比較酶的分離純化方法，提取枸杞中可能有糖基轉(zhuǎn)移活性的酶，進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，最終獲得的酶中，無一具有糖苷轉(zhuǎn)移活性。 從產(chǎn)纖維素酶菌種中篩選到產(chǎn)糖苷轉(zhuǎn)移酶的菌種，提取粗酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化，LC/MS檢測轉(zhuǎn)化液、枸杞提取物和標(biāo)樣，確定轉(zhuǎn)化液中含有和標(biāo)樣相同分子量的物

3、質(zhì)，枸杞提取物中的主要物質(zhì)也與標(biāo)樣分子量一致，三者分子量均為338。通過DPPH自由基清除法發(fā)現(xiàn)，1 min內(nèi)抗壞血酸清除自由基效果迅速，之后趨勢減緩，此時(shí)AA-2βG的清除優(yōu)勢開始顯現(xiàn)，而轉(zhuǎn)化液中同步合成的相同分子量的AA-6βG不具有抗氧化性的，AA-2βG清除自由基的總量大于抗壞血酸，證實(shí)了報(bào)道中1分子AA-2βG清除大于1分子自由基的說法。 在此基礎(chǔ)上，對(duì)該菌種的發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，得到以下最佳發(fā)酵條件：稻草粉15.0

4、％，麩皮5.0％，（NH4）2SO40.4％，MgSO40.012％，1倍CMC的吐溫-40，10 mL自來水，pH自然，放入250 mL錐形瓶中，接種量為1 mL培養(yǎng)48 h的種子培養(yǎng)液，32℃下培養(yǎng)4d。對(duì)轉(zhuǎn)化過程中糖基供體濃度、VC濃度、加酶量和轉(zhuǎn)化時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，初步確立合適的轉(zhuǎn)化條件為：以濃度為40 mg/mL纖維二糖作為葡萄糖基供體，濃度為40 mg/mL的維生素C作為受體，16 mgmL酶濃度，以pH5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖