內(nèi)皮祖細(xì)胞聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞治療異丙腎上腺素?fù)p傷性心肌病效果與機(jī)制的研究.pdf

1、目的:干細(xì)胞治療是新興的治療心血管疾病的方法,為心肌病的治療提供了新的策略。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)和間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是骨髓干細(xì)胞最重要的組成成分,是干細(xì)胞研究和組織工程學(xué)研究的重要種子細(xì)胞。目前國(guó)內(nèi)外絕大部分基礎(chǔ)和臨床研究均選用單一的內(nèi)皮祖細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞,在治療缺血性心肌病或擴(kuò)張型心肌病的研究中,取得了令人鼓舞的結(jié)果。EPCs和MSCs具有不同的生物學(xué)行為:實(shí)驗(yàn)證實(shí)前者在體外培養(yǎng)或移植到體內(nèi)可分化為內(nèi)皮細(xì)胞,可以修復(fù)受損的血

2、管內(nèi)皮并參與血管新生;而后者具有多向分化潛能,與心肌細(xì)胞共同培養(yǎng)及用5氮雜胞苷誘導(dǎo)在體外可以分化為心肌細(xì)胞,移植到體內(nèi)4周就可以表達(dá)心肌細(xì)胞的特異性標(biāo)志,并可以和原有的心肌細(xì)胞形成連接,將其移植到心肌內(nèi)可以彌補(bǔ)丟失的心肌細(xì)胞。大劑量的兒茶酚胺類藥物具有心肌細(xì)胞毒性,可引起心肌細(xì)胞的壞死并進(jìn)而發(fā)展為心肌病。異丙腎上腺素(ISO)皮下注射誘導(dǎo)的心肌病是經(jīng)典的兒茶酚胺類藥物中毒性心肌病模型,我們研究的目的是將EPCs和MSCs聯(lián)合移植于ISO

3、損傷的大鼠心肌,觀察其對(duì)心功能、血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)和心肌局部血流的影響,并探討其對(duì)兒茶酚胺類藥物中毒性心肌病的治療效果和可能的相關(guān)機(jī)制,為心肌病的治療尋找新的思路,并為EPCs和MSCs聯(lián)合移植治療的臨床應(yīng)用提供線索和依據(jù)。方法:骨髓細(xì)胞懸液取自SD大鼠的股骨和脛股,用Ficoll分離液和差速貼壁法分離雄性SD大鼠的骨髓單個(gè)核細(xì)胞,分別用EGM-2和DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)EPCs和MSCs,用于細(xì)胞移植的干細(xì)胞為原代培養(yǎng)的EPCs和第三代MSC

4、s。90只雌性SD大鼠,通過腹股溝皮下注射ISO(250mg/kg)制作兒茶酚胺類藥物中毒性心肌病模型。將65只模型成功的大鼠隨機(jī)分為五組,假手術(shù)組(開胸手術(shù)并注射生理鹽水)、對(duì)照組(只注射EBM-2培養(yǎng)液)、MSCs組(注射2×106個(gè)MSCs)、EPCs組(注射2×106個(gè)EPCs)、MSCs+EPCs組(注射1×106個(gè)EPCs和1×106個(gè)MSCs),在直視下分5點(diǎn)將干細(xì)胞直接注射到大鼠的心肌內(nèi)。在注射ISO前、注射藥物四周和細(xì)

5、胞移植三個(gè)月后,分別做心臟超聲測(cè)量其左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮期末期內(nèi)徑(LVESD)、室間隔厚度(IVST)、左室前壁厚度(LVAWT)、后壁厚度(LVPWT),計(jì)算左室收縮末期容積(LVESV)、左室舒張末期容積(LVEDV)、左室射血分?jǐn)?shù)(EF)、短軸縮短率(FS)。在細(xì)胞移植后三個(gè)月,處死動(dòng)物之前,通過頸動(dòng)脈插管到左心室,測(cè)量左室收縮期壓力上升和下降的最大速度(±dp/dt),左室舒張期末壓力(LVEDP);應(yīng)用彩

6、色微球技術(shù)評(píng)估心肌局部血流(RMBF);Y染色體原位雜交和免疫熒光技術(shù)確定雌性大鼠心肌標(biāo)本中移植的雄性干細(xì)胞的定位和分化;應(yīng)用免疫組化技術(shù)通過vWF染色半定量分析心肌組織內(nèi)毛細(xì)血管密度;Massion’s染色分析心肌組織纖維化程度;Tunel染色評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞凋亡的比率。同時(shí)測(cè)量心肌組織內(nèi)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF),堿性成纖維生長(zhǎng)因子(b-FGF)及血管生成素2(Ang-2)的濃度及其mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果:90只雌性大鼠注射ISO四

7、周后有71存活,其中有6只因EF下降未超過20％被排除,其余65只大鼠被隨機(jī)分為五組(每組13只),手術(shù)及干細(xì)胞移植后各組均有大鼠死亡,終點(diǎn)時(shí)每組存活的大鼠:假手術(shù)組11只、對(duì)照組11只、MSCs組10只、EPCs組9只、MSCs+EPCs組11只。藥物注射后4周,與基線比較大鼠的EF、FS明顯下降(P＜0.05);LVEDD、LVESV、LVEDV明顯增加(P＜0.05)。細(xì)胞移植3月后,接受細(xì)胞治療的三組(MSCs組、EPCs組和E

8、PCs+MSCs組)EF、FS較細(xì)胞移植前明顯改善(P＜0.05);LVEDD、LVESV、LVEDV較移植前有明顯的縮小(P＜0.05);細(xì)胞移植組與對(duì)照組和假手術(shù)組比較也有明顯差異(P＜0.05);而假手術(shù)組和對(duì)照組與手術(shù)前比較,各項(xiàng)指標(biāo)都沒有明顯變化,兩組間比較也沒有明顯差異(P＜0.05)。細(xì)胞移植后三個(gè)月,接受細(xì)胞移植三組動(dòng)物的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo):±dp/dt、LVEDP較假手術(shù)組和對(duì)照組有明顯的改善,表現(xiàn)為±dp/dt加快, L

9、VEDP降低(P＜0.05)。更重要的是EPCs+MSCs組與MSCs組、EPCs組比較,除LVEDD外的各項(xiàng)心功能指標(biāo)及血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)改善得更為明顯(P＜0.05);但是MSCs組和EPCs組比較沒有明顯差別(P＞0.05)。LVEDD在接受細(xì)胞治療的三組中比較沒有明顯差異(P＞0.05)。彩色微球技術(shù)測(cè)定RMBF是評(píng)價(jià)心肌血流灌注的金指標(biāo),我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EPCs+MSCs組和EPCs組的RMBF在五組中是最高的(P＜0.05);MS

10、Cs組也高于對(duì)照組和假手術(shù)組(P＜0.05);但EPCs+MSCs組與EPCs組比較沒有顯著性差異(P＞0.05)。心肌內(nèi)毛細(xì)血管密度檢測(cè)結(jié)果解釋了RMBF在各組間出現(xiàn)差異的原因,EPCs+MSCs組和EPCs組心肌內(nèi)毛細(xì)血管密度明顯高于MSCs組、對(duì)照組和假手術(shù)組(P＜0.05);EPCs+MSCs組和EPCs組比較、對(duì)照組和假手術(shù)組比較均沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。Y染色體原位雜交能檢測(cè)到雌性大鼠心肌內(nèi)移植的雄性干細(xì)胞,結(jié)果

11、顯示:EPCs+MSCs組和MSCs組心肌細(xì)胞、血管和間質(zhì)組織內(nèi)可以觀察到Sry陽(yáng)性細(xì)胞;而EPCs組只能在血管壁內(nèi)看到Sry陽(yáng)性細(xì)胞。假手術(shù)組和對(duì)照組沒有發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞。為了明確移植細(xì)胞的分化方向,我們應(yīng)用免疫熒光技術(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)EPCs組移植的細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志(vWF),而MSCs組一些移植的細(xì)胞表達(dá)心肌細(xì)胞表面標(biāo)志(troponin T)。其次無(wú)論是單獨(dú)移植還是兩種細(xì)胞聯(lián)合移植都減輕了心肌纖維化程度和心肌細(xì)胞的調(diào)亡比率(P＜0

12、.05),而EPCs+MSCs組減輕的程度明顯大于其它四組(P＜0.05)。我們的研究還證實(shí)心功能的改善、心肌血流灌注和心肌內(nèi)血管密度的增加與心肌內(nèi)血管生長(zhǎng)因子:VEGF、b-FGF、Ang-2分泌增多有關(guān),而它們的分泌與其mRNA轉(zhuǎn)錄水平增高是一致的。MSCs組心肌組織內(nèi)VEGF,b-FGF及Ang-2蛋白的濃度與假手組和對(duì)照組相比明顯升高(P＜0.05),但比EPCs+MSCs組和EPCs組低(P＜0.05),對(duì)照組與假手術(shù)之間比較

13、沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。值得提到的是:EPCs組的b-FGF水平較EPCs+MSCs組更高,P＜0.05。QRT-PCR分析顯示EPCs+MSCs組和EPCs組VEGF、b-FGF、Ang-2mRNA的轉(zhuǎn)錄高于MSCs組、假手術(shù)組和對(duì)照組(P＜0.05)。但b-FGFmRNA的表達(dá)在EPCs組和EPCs+MSCs組沒有明顯差別(P＞0.05),假手術(shù)組和對(duì)照組三種細(xì)胞因子mRNA的比較均沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。結(jié)論: