日本醫(yī)蛭中活性蛋白的親和技術(shù)研究.pdf

1、日本醫(yī)蛭是中國(guó)藥典(2000年版)的收錄水蛭藥材之一，水蛭中含有約2，000 多種分子量在2 ~ 20 kDa 之間的微量蛋白或多肽，其中不乏新藥開(kāi)發(fā)的候選藥物和先導(dǎo)物質(zhì)，特別是治療心腦血管系統(tǒng)疾病的物質(zhì)。但是由于組織蛋白提取尤其是微量蛋白提取方面的困難，目前水蛭活性成分的開(kāi)發(fā)研究主要是水蛭素，其它活性蛋白尚未開(kāi)發(fā)，造成水蛭資源的大量浪費(fèi)。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)合成含有700根仿生親和介質(zhì)庫(kù)，并選取297根仿生親和介質(zhì)柱對(duì)水蛭粗提液的

2、蛋白進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示有36根介質(zhì)柱能對(duì)日本醫(yī)蛭蛋白一步純化，有154根親和介質(zhì)柱對(duì)其低豐度蛋白有富集作用，有83根介質(zhì)柱對(duì)高豐度蛋白有剔除作用，充分驗(yàn)證了仿生親和介質(zhì)庫(kù)在蛋白純化和蛋白組學(xué)研究中的有效性。通過(guò)對(duì)一步純化出的蛋白進(jìn)行抗凝血活性分析，我們選擇了其中的一種活性蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的分析研究。該蛋白是一種低豐度蛋白，具有抗凝血活性，其分子量為 13,800 Da，蛋白回收率可達(dá)到69.2 ％，其在血漿中含量為0.02 mg/ml時(shí)即

3、可產(chǎn)生明顯的抗凝血現(xiàn)象，利用MALDI-TOF-TOF分析，在蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中未找到與之相似蛋白或多肽，因此確定為新蛋白，命名為NLP-1(New Leech Protein-1)。 此外，我們還考慮通過(guò)固定藥物靶點(diǎn)的方法制備親和介質(zhì)，并以此來(lái)篩選活性物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)牛血清白蛋白(BSA)與介質(zhì)先離子交換吸附，再用1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）縮合固定的方法制備親和介質(zhì)，此種新方法所固定BSA的量與N-羥